新城疫病毒弱毒株分子生物学特性的研究

于 1 996年从长春地区一养鸡场分离到一株新城疫病毒 (NDV长春株 ) ,经过病毒生物学特性的研究表明该NDV毒株为弱毒株。将NDV长春株纯化培养后 ,提取病毒RNA ,经RT_PCR扩增F基因 ,并测定出F基因的全部核苷酸序列为1 75 8bp ,编码有 5 5 3个氨基酸残基。与国内外发表的部分NDV病毒的强毒株和弱毒株的相同序列进行比较 ,其核苷酸同源性在 88.2 %～ 96 .7%之间 ,氨基酸同源性在 90 .1 %～ 98.1 %之间 ,并与所有弱毒株F蛋白裂解位点区 (1 1 2～ 1 1 7)氨基酸序列Gly_Arg/Lys_Gln_Gly/Ser_Arg_Leu相同 。

人免疫缺陷病毒II型gag基因在毕赤酵母中表达条件的研究

目的 :提高人免疫缺陷病毒 II型 ( HIV- 2 ROD) gag基因在毕赤酵母中的表达量。方法 :研究了转化子生长的培养条件 ,包括不同的甲醇诱导浓度、诱导时间、溶解氧、摇瓶转速及不同 p H值对人 HIV- 2 gag表达的影响。表达产物进一步通过盐析和 Sephadex G- 1 0 0分子筛层析柱层析分离纯化。结果 :最佳表达条件是 1 .0 %甲醇诱导 ,诱导时间 3d,大于 85 %的溶解氧 ,摇瓶转速2 5 0 r·min-1,p H6.0～ 6.5 ,目的蛋白表达量达到 2 1 mg· L-1。同时 ,经纯化后得到了纯度大于95 %的目的蛋白。结论 :获得了 HIV- 2 RODgag重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中分泌表达的最佳表达条件。

新城疫病毒在不同的细胞上增殖特性的研究

研究新城疫病毒 (NewscastlediseaseVirus,NDV)强、弱毒株在不同的传代细胞的生物学特征。F4 8E8强毒株在BHK、Vero和CEF中都能增殖并产生细胞病变 ,而V4生弱毒株不能在BHK和Vero中增殖。当MEM含 1 0ug/mL胰蛋白酶时 ,NDV弱毒株在BHK和Vero中能较好地复制 ,将V4株在Vero中传代培养后 ,Vero中传代的V4毒株的HA较低 ,但毒力增强 ,BHK中传代的V4毒株的毒力和HA都提高 ,能达到其鸡胚毒上的毒力和HA效价。如果进一步研究能够证实在BHK上适应增殖的V4毒株的免疫原性比较好 ,那么就可能用BHK细胞系替代鸡胚增殖V4株作为疫苗的病毒抗原。使用BHK等传代细胞制备的NDV疫苗具有避免传统疫苗散播其他疾病的危险、降低成本和大规模生产等优点。使用传代细胞代替鸡胚来生产NDV疫苗 。

中国流行株HIV-1gag和hIL-2/hIL-6核酸疫苗构建与实验免疫研究

目的探讨中国流行株 HIV- 1gag与 h IL - 2 /h IL - 6共表达重组核酸疫苗质粒的免疫效果。方法以核酸疫苗质粒 p IRES1neo为表达载体 ,构建重组核酸疫苗质粒 p IRES1- gag、p IRES1- gag- h IL- 2、p IRES1- gag- h IL- 6 ,通过间接免疫荧光试验、Dot- EL ISA检测 gag/h IL - 2 /h IL - 6基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫 Balb/c小鼠 ,进行淋巴细胞转化试验、CD4+ 、CD8+ T淋巴细胞数量测定、细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL )特异性杀伤作用检测及血清抗体检测 ,结果构建的重组质粒转染 BHK细胞后可表达目的基因 ,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖、诱导特异性 CTL 反应 ,当和 h IL- 2 /h IL- 6共表达时免疫效果更加显著。讨论与 Gag蛋白共表达的 h IL- 2 /h IL- 6能够进一步增强免疫鼠的细胞免疫与体液免疫水平 ,构建的重组质粒为 HIV-

鸡新城疫病毒抗肿瘤作用及其机制的研究进展

鸡新城疫病毒 (newcastlediseasevirus,NDV)感染机体可以诱导产生干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等细胞因子 ,这些细胞因子能够在患瘤机体内发挥抗肿瘤作用。NDV的附着蛋白 (hemagglutinin -neuramidase ,HN蛋白 )具有增加瘤细胞对淋巴细胞的粘附力、刺激淋巴细胞的分化和改变肿瘤细胞的免疫原性等作用 ,同时NDV可以激活患瘤机体的免疫细胞 ,使免疫细胞发挥细胞毒性功能。NDV免疫机体后可以发挥这些抗肿瘤作用 ,提高机体的免疫力 ,促进机体的抗肿瘤反应 ,减少肿瘤的生长、转移和复发 ,增加肿瘤病人的存活率 。

HIV-1重组核酸疫苗质粒诱导小鼠免疫应答的研究

目的 研究白细胞介素 6(IL 6)对人类免疫缺陷病毒 (HIV)gp1 2 0基因免疫小鼠的调节作用。方法 构建表达中国流行株HIV 1B亚型gp1 2 0基因的核酸疫苗质粒pGP及共表达中国流行株HIV 1B亚型gp1 2 0基因与IL 6基因的核酸疫苗质粒pGPIL 6 ,检测其在哺乳动物细胞中的表达并将上述两种质粒注射Balb/c鼠 ,检测小鼠产生的CD4+ 和CD8+ T细胞数情况及诱导CTL反应能力。结果 以间接免疫荧光法 (IFA)检测到gp1 2 0在哺乳动物细胞中得到表达。pGPIL 6免疫鼠 ,小鼠产生的CD4+ 和CD8+ T细胞数及诱导产生CTL反应的能力明显高于单独注射gp1 2 0的小鼠。结论 协同应用IL 6基因可明显加强HIV 1gp1 2 0基因免疫效果 ,为中国流行株HIV

整联蛋白研究进展

对细胞膜信号转导过程中起重要作用的整联蛋白的结构和功能、整联蛋白与肿瘤生长和转移的关系。

HIV-1中国流行株gag与hIL-2在重组痘苗病毒中的共表达及其与核酸疫苗的实验免疫研究

目的：将HIV-1中国流行株B亚型gag基因、gag和hIL-2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达，以期获得重组痘苗病毒，观察细胞因子的佐剂作用，与核酸疫苗混合免疫，评价免疫效果，为新型艾滋病疫苗研制开发打下基础。方法：将HIV-1中国流行株 gag基因、gag和hIL-2基因片段插入到 pJ38载体启动子下游，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒，SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫Balb/c小鼠，进行淋巴细胞转化实验、CTL、CD4+、CD8+ T细胞数目以及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测。结果：获得了重组痘苗病毒 vJ38gag和 vJ38gag-IL-2。与 vJ38-gag相比，vJ38gag-IL-2，具有更好的免疫原性，重组痘苗病毒免疫3次的效果好于重组病毒免疫2次，以2rVV-DNA混合免疫效果最好。结论：重组痘苗病毒vJ38gag和vJ38gag-IL-2能够表达外源蛋白并诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。细胞因子IL-2发挥了免疫佐剂的作用。

HIV-1gag/IFNα-2b表达产物的生物活性研究

目的 :将艾滋病病毒核心蛋白 (gag)与干扰素 (IFNα - 2b)融合基因表达的融合蛋白作为免疫原免疫小鼠 ,动态观察小鼠的体液免疫、细胞免疫与CTL应答。方法 :将IFNα - 2b基因片段插入到gag基因的nt5 31位点 ,经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选 ,挑出重组痘苗病毒。经SDS -PAGE和Westernblot鉴定表达产物。以小鼠为实验对象 ,用重组痘苗病毒vJ38gag/IFNα - 2b免疫小鼠 ,用ELISA方法检测血清IgG抗体含量。用流式细胞仪测定小鼠外周血CD+ 4 、CD+ 8T淋巴细胞计数。 3H -TdR掺入法检测细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性。结果 :血清IgG抗体含量逐渐增高 ,实验组与对照组比较差异有显著性意义 (p <0 .0 5 )。CD+ 4 、CD+ 8T淋巴细胞计数、CTL检测实验组与对照组比较差异均有显著性意义 (p <0 .0 5 )。结论 :重组痘苗病毒vJ38gag/IFNα - 2b能增强小鼠的体液免疫、细胞免疫和CTL应答。IFNα - 2b可以作为免疫佐剂增强机体的免疫状态。

新城疫病毒弱毒疫苗的免疫研究

新城疫病毒长春株 (NDV CC株 )经生物学及分子生物学特性研究证明为新城疫病毒弱毒株 ,以NDV CC毒株制成弱毒疫苗 ,采用饮水、滴鼻和肌肉注射免疫等方式 ,分别免疫 7日龄雏鸡 ,免疫鸡未出现不良反应。免疫后 7d HI效价为 2 5以上 ,6 0 d后均能维持较高的 HI值 ,免疫后 1 4 d用 NDV强毒攻击 ,其保护率可达到 1 0 0 % (1 0 /1 0 )

重组鸡痘病毒与核酸疫苗联合免疫提高机体免疫功能研究

目的 :探索联合免疫对小鼠细胞免疫和体液免疫功能的影响。方法 :以表达中国流行株HIV 1核心蛋白Gag的重组鸡痘病毒vUTALG作初始免疫 ,以表达相同抗原的核酸疫苗质粒pcDNAG加强免疫 ,对被免疫鼠的细胞免疫和体液免疫功能进行初步测定。结果 :以重组鸡痘病毒首次免疫的联合免疫组与单纯用重组病毒免疫组比较 ,CD4+ T细胞数升高 ,ConA和LPS诱导的T细胞增殖能力均明显增强 ,并能诱导HIV 1特异的血清抗体反应。结论 :以重组鸡痘病毒首次免疫的联合免疫能有效的提高T ,B细胞介导的细胞免疫和体液免疫水平。

LHRH-PE40注射剂对体外培养人肿瘤细胞系的细胞毒作用

目的 观紊ＬＨＲＨ－ＰＥ４０注射剂对体外培养的人肿瘤细胞的细胞毒作用。方法 用ＭＴＴ检恻 ＬＨＲＨ－ＰＥ４０对体外培养的人肿瘤细胞的细胞毒作用，找出敏感肿瘤细胞系。结果ＬＨＲＨ－ＰＥ４０对体外培养的多 种人肿庙细胞具有细胞毒作用，细胞对药物的敏感程度依次为：ｓｍｍｕｕ７７２１（人肝癌）＜ＨＥＰＧ２（人肝癌）＜ＨＣＴ－８(人结肠癌）＜ＭＣＦ－７（人乳腺癌）＜Ａ５４９（人肺腺癌）＜ＭＧＣ－８０３（人胃癌）。结论 为动物体内的药效学研究和临 床用药提供依据。

重组传染性法氏囊病病毒VP2/VP243基因表达及保护性和免疫原性

目的在重组鸡痘病毒中表达传染性法氏囊病毒 VP2/VP243基因,并研究表达产物的保护性和免 疫原性。方法以 FPV 282E_4株 TK基因为侧翼,分别将鸡法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV) VP2 和VP243目的基因克隆到牛痘病毒A型包涵体(ATI)和痘苗病毒P7.5复合型启动子下游,构建成2个重组表达质 粒,命名为pUTALacVP和pUTA LacVPO。用这2个质粒转染CEF细胞,用X-gal染色法筛选出2株重组病毒vUTA lacVP2和 vUTALacVP0。用这 2株病毒免疫 1周龄 SPF鸡,以常规疫苗为对照。结果 ELISA、SDS-PAGE和 Western blot表明表达产物可与IBDV特异性多克隆抗体反应,并诱导鸡保护性抗体。在使用vvIBDV攻击前,对照组抗体水 平显著高于实验组。但攻击5 d后,实验组抗体水平明显升高。结论vUTALacVP2和 VPO在 CEF细胞中实现了高 效表达,但重组疫苗的保护率低于常规疫苗。

新城疫病毒F_(48)E_8株 HN基因在杆状病毒系统中表达

目的 采用新型杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)在昆虫细胞Sf-9中进行新城疫病毒F48 E8株HN基因表达。方法NDV F48 E8株 HN基因插入到转座载体 pFast Bac Ⅰ,构建重组转座载体 pFast HN,转化到感受态细胞 DH10后,将目的基因转座到穿梭载体Bacmid中,经筛选获得重组Bacmid HN转染到Sf-9昆虫细胞,并进行检测。结果 表达产物经SDS-PAGE、Westem blot检测获得蛋白特异带,相对分子质量约63000。结论NDVF48E8株HN基因能通过新型杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf-9中进行表达,表达量约为细胞总蛋白的10％。

新城疫病毒F基因与传染性法氏囊病毒VP0基因在鸡痘病毒中共表达

目的 新城疫病毒（NDV）F基因和传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP0基因在鸡痘病毒中表达,以便研制新城疫和传染性法氏囊多价重组疫苗。方法 利用鸡痘病毒282E4株非必需区TK基因构建的表达载体PU-TA2,在已存在的复合启动子p7.5ATI下游同向插入F基因,反向插入复合启动子P7.5ATI,并在其下游反向插入VP0基因,构建由2个相同的复合启动子在相反方向分别表达F和VP0蛋白的PATI2-F-VP0表达载体。使其与鸡痘病毒282E4株共转染CEF细胞后,用BUDR法筛选重组病毒,通过间接免疫荧光法检测阳性重组病毒。用Western blot法检测F和VP0蛋白。结果 在重组病毒株中,用Western blot法可检测到F和VP0蛋白。结论 已成功地获得可同时表达F蛋白和VP0蛋白的重组鸡痘病毒。

H5和H9亚型禽流感病毒联合RT-PCR检测方法的建立

目的建立H5和H9亚型禽流感病毒(AIV)联合RT-PCR检测方法。方法针对H5和H9亚型AIV血凝素(HA)基因,在其裂解位点两侧设计引物。在确定单项RT-PCR检测方法反应条件基础上,建立、优化联合RT-PCR反应体系和反应条件,并通过相关病毒检测试验,验证其敏感性和特异性。结果所建立的H5和H9亚型联合RT-PCR检测方法具有特异、敏感、简便、快捷等特点。结论该方法可用于AIV的检测及致病性分析。

中国株HIV-1核心蛋白Gag核酸疫苗的构建与表达

目的 构建含HIV 1中国流行株B亚型核心蛋白Gag基因的真核表达质粒 ,并在体外进行表达和鉴定。方法 将Gag基因插入到核酸疫苗载体质粒pVAX1中 ,构建真核表达质粒 pVAXGAG。用脂质体法 ,将重组质粒转染入Hela细胞后进行表达产物的检测。结果间接免疫荧光检测显示 ,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。Westernblot和DotELISA分析显示 ,重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的Gag蛋白。 结论构建的核酸疫苗可在体外进行表达 。

全血法和分离淋巴细胞法对犬淋巴细胞转化对比试验

通过犬全血法和分离淋巴细胞法进行淋巴细胞转化对比试验 ,试验以培养 96h,Con A浓度为 2 0 μg/m L,L PS浓度为 2 5 μg/m L ,在培养结束前 18h加入 1.0μci的 3 H-胸腺嘧啶核苷测定淋转率。试验结果表明 ,两种方法差异不显著 ,但全血法更优于分离淋巴细胞法 ,且操作简便 。

高致病性禽流感及其公共卫生学

禽流感的暴发和流行主要是由高致病性的H5和H7亚型AIV引起的。近年来高致病性禽流感的先后暴发和流行 ,特别是出现有人因感染而死亡的病例 ,更突出地显示了禽流感特别是高致病性禽流感的公共卫生学意义。对高致病性禽流感的流行病学。