微小隐孢子虫转录共激活因子CpADA2的生物信息学分析及其编码基因的真核表达

本研究旨在对微小隐孢子虫转录共激活因子ADA2的结构和功能进行生物信息学分析,对其编码基因CpADA2进行真核表达。利用在线生物信息学软件对CpADA2进行生物信息学分析,结果显示,CpADA2含有ZnF和SANT结构域,全长673个氨基酸残基,分子质量为76 kDa,属于可溶性蛋白;不含跨膜区和信号肽,但存在多样化的激酶特异性磷酸化位点;二级结构由α螺旋(36.70%)、β折叠(11.74%)和无规卷曲(51.56%)构成;三级结构中SANT结构域呈典型的α螺旋串联重复构象;互作网络模型和功能预测表明,该蛋白具有锌离子结合特性,并可能参与组蛋白乙酰化过程。以微小隐孢子虫cDNA为模板,PCR扩增得到CpADA2基因,成功构建了真核表达质粒p3×FLAG-CMV14-CpADA2,转染至293T细胞后,Western blot分析显示,转染重组质粒的细胞成功表达重组CpADA2蛋白。本研究为后续开展CpADA2的功能研究提供了基础。

旋毛虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ蛋白的制备及其定位研究

为获得旋毛虫(T1)脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNase Ⅱ)蛋白,观察其在肌幼虫虫体中的分布,以旋毛虫(T1)肌幼虫cDNA为模板,利用RT-PCR技术扩增旋毛虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ(TsDNase Ⅱ)蛋白的编码基因tsdnase Ⅱ,将其克隆到原核表达载体pCold-TF中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blot分析重组Ts DNaseⅡ(rTsDNase Ⅱ)蛋白的反应原性;将rTsDNase Ⅱ蛋白免疫6-8周BALB/c小鼠,制备其多克隆抗体;制作旋毛虫肌幼虫冰冻切片,利用免疫荧光试验观察TsDNase Ⅱ蛋白在虫体中的分布。结果,成功地扩增出了长度为942 bp的旋毛虫tsdnase Ⅱ基因片段,构建了其原核表达质粒pCold-TF-tsdnase Ⅱ;转化了重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)成功可溶表达了rTsDNase Ⅱ,大小为86 kDa;ELISA与Western blot分析结果显示,rTsDNase Ⅱ蛋白能与感染旋毛虫的小鼠血清发生特异性反应;冰冻切片免疫荧光分析显示,TsDNase Ⅱ分布于旋毛虫肌幼虫整个虫体。研究结果为进一步分析TsDNase Ⅱ的特性与功能、利用该蛋白研发旋毛虫病新型防控策略打下了基础。

基于不同靶基因的3种住肉孢子虫PCR检测方法比较

为筛选敏感、特异的住肉孢子虫(Sarcocystis spp.)PCR检测方法,对以住肉孢子虫18S rRNA、28S rRNA和线粒体细胞色素C氧化酶I基因(cox 1)的部分片段为靶基因设计的3套引物建立的PCR方法进行敏感性和特异性试验,并对田间采集的100份牛源和猪源肌肉样品进行检测。结果显示,以18S rRNA和28S rRNA为靶基因的PCR检测方法的敏感性相似,DNA最小检出量均为1×10-2 ng/μL;而以cox 1为靶基因的PCR检测方法敏感性相对较低,DNA的最低检出量为1 ng/μL。对7种不同寄生虫DNA进行特异性试验,结果以cox 1基因为靶基因的PCR方法特异性较好,仅能够扩增出枯氏住肉孢子虫(Sarcocystis cruzi)DNA;以18S rRNA为靶基因的PCR法,除枯氏住肉孢子虫外,刚地弓形虫和微小隐孢子虫也有相似扩增条带;以28S rRNA为靶基因的PCR法,除枯氏住肉孢子虫外,刚地弓形虫、微小隐孢子虫和欧猥迭宫绦虫DNA也能扩增出杂带,但大小不符。利用3种方法对100份牦牛和猪肉样品进行扩增,发现以18S rRNA、28S rRNA和cox 1为靶基因的PCR法的阳性率分别为36.00%(36/100)、43.00%(43/100)和38.00%(38/100)。结果表明,以cox 1为靶基因的PCR法有良好的特异性,适合用于田间动物肌肉样品中住肉孢子虫的检测,为开展动物住肉孢子虫病分子流行病学及防控研究提供了依据。

宁夏吴忠市羊隐孢子虫感染情况调查及虫种鉴定

为了解宁夏回族自治区吴忠市羊隐孢子虫病流行情况,从吴忠市的2个规模羊场采集480份粪便样品。提取基因组DNA,用套式PCR扩增隐孢子虫SSUrRNA基因,阳性样品进行测序分析。结果显示,吴忠市羊隐孢子虫感染率为28.3%,其中盐池县绵羊感染率为33.8%,同心县山羊感染率为22.9%;共发现3种隐孢子虫感染,其中肖氏隐孢子虫(Cryptosporidium xiaoi)阳性率最高(62.5%),其次是泛在隐孢子虫(C.ubiquitum)(32.4%),微小隐孢子虫(C.parvum)感染率最低(5.2%);从季节上看,春季感染率最高(49.2%),夏季最低(6.7%);从羊的年龄上看,未断奶羔羊感染率最高(34.4%),而成年羊感染率最低(19.4%);序列比对结果显示,所有阳性样品均在Gen Bank找到100%同源的序列。本研究首次对宁夏羊感染的隐孢子虫进行了分子鉴定,为深入了解宁夏吴忠市羊隐孢子虫病流行情况、制定有效的防控措施提供了依据。

贝氏隐孢子虫及其与大肠杆菌共感染对雏鸡肠道菌群的影响

为调查贝氏隐孢子虫单独以及与禽致病性大肠杆菌合并感染对雏鸡肠道菌群的影响,将1日龄SPF级雏鸡分为隐孢子虫单独感染组(灌胃隐孢子虫1×10^(6)个/只)、隐孢子虫和大肠杆菌共感染组(肌注大肠杆菌2×106 CFU/只,同时灌胃隐孢子虫1×10^(6)个/只)与健康对照组,分别于接种后第3、9、15、21和27天采集新鲜粪便,提取DNA后进行16S rRNA高通量测序及生物信息学分析。结果显示,3组雏鸡肠道微生物相对丰度最高的门为厚壁菌门,其次为拟杆菌门和变形菌门。多样性分析表明,2组感染雏鸡的肠道菌群多样性降低,但隐孢子虫单独感染组较共感染组先恢复。从属水平分析发现,与健康对照组比较,共感染组的乳杆菌属丰度明显降低(P<0.05),而大肠/志贺菌属则显著升高(P<0.05),两者此消彼长。2感染组雏鸡肠道中的布劳特菌属和瘤胃球菌属伴随雏鸡日龄增长呈上升趋势,但相比健康对照组绝对丰度较低。以上结果表明,大肠杆菌的共感染可加剧隐孢子虫感染造成的雏鸡肠道微生物多样性和菌群结构的变化,这可能与采食量的改变以及对免疫力和代谢功能的影响有关。

感染微小隐孢子虫绵羊的血常规及血清抗体动态变化

为了解绵羊感染微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)后的临床症状、血常规与抗体变化,以及卵囊排出情况,以新生羔羊为感染模型,经口接种1×10^(6)个C.parvum卵囊,每日对羔羊的临床症状进行计分,同时每3 d进行羔羊血常规分析、血清抗体检测和排卵囊数量检测。研究结果表明,羔羊在感染后3~5 d出现食欲下降、精神沉郁、腹泻、体重增长减缓等症状,腹泻羔羊粪便镜检发现大量卵囊,但感染后期症状不明显。血常规分析显示,羔羊出现了严重的炎症反应,感染组羔羊的白细胞(WBC)和血小板(PLT)数量增多,红细胞(RBC)数量减少。ELISA检测显示,感染组羔羊于感染后第3 d抗体水平就达峰值,随后缓慢下降,持续到试验结束。荧光定量PCR结果表明,羔羊出现2个排卵囊高峰期。本研究首次对绵羊感染隐孢子虫后的血液指标进行了分析,为隐孢子虫病临床诊断提供了辅助参考。

伊犁河谷新疆褐牛隐孢子虫感染情况调查

为了解伊犁河谷区域新疆褐牛隐孢子虫病流行情况,从该地区的伊宁市和察布查尔锡伯自治县的4个养殖场采集356份粪便样品,提取基因组DNA,以隐孢子虫小亚基核糖体DNA(SSU rDNA)为靶基因,进行套式PCR扩增,并对阳性样品进行序列分析。结果显示:伊宁市和察布查尔锡伯自治县各有1个养殖场的新疆褐牛发现隐孢子虫感染,总的感染率为3.37%,其中伊宁市褐牛的感染率为4.10%,察布查尔锡伯自治县褐牛的感染率为2.48%;序列比对结果显示,存在2种隐孢子虫感染,分别为安氏隐孢子虫(C.andersoni)和瑞氏隐孢子虫(C.ryanae),其中C.andersoni是优势种(91.67%);成年牛的感染率最高(5.59%),而断奶前犊牛未发现隐孢子虫感染;冬季感染率(5.68%)显著高于春季(1.11%)(P<0.05)。本研究首次对伊犁河谷区域新疆褐牛感染的隐孢子虫进行了分子鉴定,发现褐牛的隐孢子虫感染率显著低于我国其他品种牛的感染率。该研究结果为深入了解新疆褐牛隐孢子虫的流行情况,制定有效的防控措施提供了数据支持。

弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D基因的原核表达及蛋白定位研究

为表达弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列(surface antigen glycoprotein 1-related sequences,SRS47D)并确定其在弓形虫中的定位,本研究将SRS47D基因序列插入原核表达载体pColdⅠ,构建原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,Western blot分析重组蛋白的反应原性;利用His柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔,制备抗血清,通过间接ELISA检测血清效价;利用免疫荧光法检测蛋白在弓形虫速殖子中的定位。结果显示:成功构建了原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,表达产物约为55 kDa;重组蛋白能与感染弓形虫的小鼠血清发生特异性反应,免疫兔血清效价达到1∶51 200;免疫荧光检测结果显示,SRS47D蛋白分布在弓形虫速殖子表面,尤其前部和后部表膜。上述结果为进一步深入研究弓形虫SRS47D的特性和功能奠定了基础。

细粒棘球蚴可溶性耐药相关钙结合蛋白的生物信息学分析及反应原性鉴定

目的采用在线生物信息学软件对细粒棘球蚴可溶性耐药相关钙结合蛋白(EgSorcin)的理化特性、结构和功能进行预测和分析,原核表达细粒棘球蚴sorcin基因,鉴定重组蛋白的反应原性,为研发细粒棘球蚴病新型防控制剂提供依据。方法从GenBank数据库下载EgSorcin的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列,运用在线生物信息学软件预测EgSorcin蛋白的理化性质、保守结构域、翻译后修饰位点、T细胞和B细胞抗原表位、二级和三级结构;比对分析不同物种间Sorcin序列的一致性,构建系统发育进化树。提取细粒棘球绦虫原头蚴总RNA,RT-PCR扩增egsorcin基因片段,构建重组质粒pET-28a-egsorcin,转化大肠埃希菌,原核表达重组EgSorcin蛋白,利用Western blot鉴定该蛋白的反应原性。结果生物信息学软件预测EgSorcin编码基因长519 bp,编码172个氨基酸残基。该蛋白含有5个EF-Hand结构域,属于EF-Hand蛋白家族;含有10个潜在的B细胞表位、6个CTL细胞表位和11个Th细胞表位;二级结构以α螺旋为主,占58.14%;EgSorcin的三级结构模型为同型二聚体。成功扩增egsorcin基因片段并构建重组质粒pET-28a-egsorcin,利用原核表达系统表达的重组EgSorcin蛋白分子质量约为20 ku,与预期相符。Western blot分析显示,该重组蛋白可与细粒棘球蚴感染羊血清、细粒棘球绦虫感染犬血清反应,而不与健康羊血清、健康犬血清反应。结论EgSorcin蛋白含有5个EF-Hand结构域及多个B、T细胞表位;原核表达的重组EgSorcin蛋白具有良好的反应原性,可能成为潜在的细粒棘球蚴病诊断候选抗原分子。

微小隐孢子虫假定棒状体蛋白CpPRP1 sushi结构域片段的生物信息学分析

目的预测微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)假定棒状体蛋白1(putative rhoptry protein-1,CpPRP1)中Sushi结构域(CpSushi)蛋白片段的结构、理化性质、翻译后修饰位点及抗原表位等信息。方法利用在线软件Protparam分析CpSushi蛋白片段的等电点、消光系数、分子质量等理化性质;利用Protscale软件分析蛋白片段的亲/疏水性;利用SignalP软件预测其信号肽;利用TargetP软件预测其亚细胞结构;利用KinasePhos、NetPhos以及NetOGlyc、NetNGlyc、NetCGlyc软件分别预测其翻译后激酶磷酸化、磷酸化及O/N/C-GlcNAc糖基化位点;利用SOPMA、COILS、Bcepred软件分别分析其二级结构、卷曲螺旋,以及柔韧性、表面可及性、转动、暴露表面及抗原倾向;TMHMM软件预测其跨膜结构域;ABCpred、Syfpeithi软件分别预测其B、T细胞抗原表位;STRING软件预测与其互作的蛋白。结果CpSushi蛋白片段有237个氨基酸残基,分子质量为26 ku,有两个疏水峰;该蛋白无信号肽、跨膜结构域;α-螺旋、延伸链、β转角、无规则卷曲所占比例分别为28.27%、18.99%、8.86%和43.88%,且能形成规则的卷曲螺旋结构;含有22个O-GlcNAc和2个N-GlcNAc-糖基化修饰位点,但缺乏C-GlcNAc糖基化位点;其氨基酸序列中存在多处丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化位点,蛋白的柔韧性(临界值1.9)、极性(临界值1.8)、亲水性(临界值1.9)位点分别有16、18和8个;含有2个Turn(临界值2.4)位点、7个抗原倾向(临界值1.9)位点、14个表面可及性(临界值1.9)位点、12个暴露表面(临界值2.3)位点,以及3个B细胞表位、7个限制性CTL细胞表位、9个限制性Th细胞表位;STRING分析显示,与该蛋白片段互作的隐孢子虫蛋白有10个。结论隐孢子虫CpPRP1 Sushi结构域蛋白片段具有良好的免疫原性,可成为潜在的隐孢子虫病疫苗候选分子。