产肠毒素大肠杆菌F17菌毛黏附亚基单克隆抗体的制备及其抗原表位分析

为获得产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F17菌毛黏附亚基G的单克隆抗体(MAb)及其抗原表位信息,本研究通过原核表达系统表达了重组F17-G蛋白(rF17-G-His)并纯化,SDS-PAGE和western blot检测结果显示表达的rF17-G-His大小为53 ku,纯化后条带单一。利用该重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了F17-G的MAb并制备腹水,采用间接ELISA、SDS-PAGE、western blot、抗体亚类鉴定试剂盒对所获得的MAb进行鉴定。结果显示,获得了3株可稳定分泌MAb的阳性杂交瘤细胞株F2G、C3G、E5G。3株MAb亚类均为IgG1,轻链为κ链,其中MAb F2G效价最高,上清效价为1:2 048,腹水效价为1:1 000 000。3株MAb均不与其他菌毛反应,具有较强的特异性。其中MAb E5G可以有效抑制ETEC DN1502株黏附肠上皮细胞。对MAb识别的抗原表位鉴定和分析结果显示,MAb F2G识别的抗原表位区域是aa1~aa15:1AAVSFIGSTENDVGP15,MAb C3G识别的表位区域是aa211~aa225:211GTTSLKLQCDAGVTV225,二者均为线性表位。MAb E5G识别的是构象表位,且位于凝集素结构域第89位天冬氨酸。采用软件分析F17-G生物学特性,结果显示,F17-G是稳定的亲水性蛋白,aa1~aa15是较活跃的表位区域,aa1~aa15、aa211~aa225在变体F17-G1、F17-G2中较为保守,aa89在3个变体中均高度保守。综合分析后认为MAb E5G具有预防和治疗携带F17菌毛ETEC引发的疾病的潜力。本研究为相应疾病的新型药物、诊断方法和疫苗的研发提供了有效生物制剂和可靠的生物学信息。

表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌微胶囊制备工艺的优化

为使重组乳酸乳球菌在发酵生产后便于存储、运输,本试验利用可表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363制备微胶囊,优化微胶囊的制备工艺条件,并对胶囊化后重组菌的相关生物学特性进行检测。通过对不同壁材及壁材浓度进行控制单一变量试验,测定其包埋量,以筛选出最佳壁材及浓度。通过模拟胃肠液环境试验,比较微胶囊释放率,并对不同壁材进行保存期试验,比较最低活菌数,利用响应面试验确定最佳工艺条件,使用最佳工艺条件制备微胶囊后进行验证。优化后的结果为:选取海藻酸钠和壳聚糖作为壁材,在海藻酸钠浓度为2.49%,壳聚糖浓度为0.96%,CaCl_(2)浓度为6.67%,凝固时间为57 min的条件下微胶囊效果最佳,预测包埋量为7.85×10^(8) CFU/g。微胶囊在模拟胃液中稳定存在,在模拟肠液中可完全破裂,能释放出微胶囊内95%以上的乳酸乳球菌。海藻酸钠-壳聚糖微胶囊在4℃保存3周后,微胶囊中活菌数为1.41×10^(7) CFU/g。对微胶囊的最佳工艺条件验证结果为微胶囊的包埋量为8.08×10^(8) CFU/g;常温保存2周后,活菌数仍可达到3.89×10^(6) CFU/g;ELISA方法检测微胶囊内重组乳酸乳球菌可见表达的牛乳铁蛋白肽,抑菌试验可见微胶囊内重组乳酸乳球菌表达的牛乳铁蛋白肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌仍具有明显的抑制作用。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌可制备成为低成本、保存期长、耐胃液的微胶囊,为重组乳酸菌在生产中的进一步应用奠定基础。