C型凝集素(C-typelectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术...C型凝集素(C-typelectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Westernblot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1357bp,包括125bp的5′末端非翻译区(UTR)、1026bp的开放阅读框(ORF)和206bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12~48h时MnLec3表达量显著升高,48h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。展开更多
文摘为了解大口黑鲈(Micropterus salmoides)的种质资源遗传背景,采用11个微卫星位点研究了大口黑鲈原种(加州原种)、从台湾省引进的台湾选育种(台湾加州鲈)和大陆本土化的养殖种(优鲈1号)的遗传多样性及遗传结构。结果显示:加州原种的等位基因数和有效等位基因数显著高于优鲈1号和台湾加州鲈;其中,加州原种的5个位点的观察杂合度和期望杂合度显著高于优鲈1号和台湾加州鲈,而后两者类似。从多态信息含量来看,加州原种群体中有11个位点处于高度多态水平,优鲈1号群体和台湾加州鲈群体分别有6和4个位点处于高度多态水平。在遗传平衡检验中发现:台湾加州鲈群体中偏离哈代-温伯格平衡的位点较多(P<0.05),而加州原种存在3个连锁座位对的连锁不平衡状态(P<0.05)。在双相突变模型中,无论是WILCOXON检验还是符号检验,加州原种群体均处于突变-漂移不平衡状态。分子方差分析(analysis of molecular variance,AMOVA)发现:大口黑鲈群体中15.57%的遗传变异来自群体间,25.05%的遗传变异来自群体内个体间,59.38%的遗传变异来自个体间(P<0.01)。聚类分析发现:加州原种和优鲈1号之间的遗传距离最大,其次为加州原种和台湾加州鲈之间的遗传距离。当K为2时,加州原种与优鲈1号、台湾加州鲈的遗传结构有明显的差异。对个体的种群鉴定发现:加州原种群体被误判的比例最低,其次是优鲈1号,最后是台湾加州鲈。在判别准确率为85.00%的水平上,加州原种被判别正确的概率是67.70%,优鲈1号是53.30%,台湾加州鲈是20.00%。从遗传多样性、遗传距离、平衡分析均发现,加州原种多态性高,遗传距离较另外2个群体较远,并可能存在过遗传瓶颈,聚类和个体的种群鉴定进一步证明了此观点。这提示从美国引进的大口黑鲈原种应该扩群保种并系统地进行育种开发工作。
文摘C型凝集素(C-typelectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Westernblot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1357bp,包括125bp的5′末端非翻译区(UTR)、1026bp的开放阅读框(ORF)和206bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12~48h时MnLec3表达量显著升高,48h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。