犬细小病毒CPV-2c型亚洲株分离鉴定及VP2基因序列分析

为探明北京某犬场犬的死亡原因,从患有肠道出血的犬肛拭子中分离出1株犬细小病毒,试验通过PCR、血凝和间接免疫荧光试验方法对毒株进行鉴定,并对VP2基因进行克隆测序和序列分析,确定其遗传分支。结果表明,该分离株属于犬细小病毒CPV-2c型,命名为CPV-BJ21株。应用犬细小病毒单克隆抗体进行间接免疫荧光检测,结果为阳性;基因序列分析表明,分离株与犬细小病毒为同一进化分支,VP2基因核苷酸序列与中国四川的CPV-2c(MH476581.1)同源性达99%,与亚洲分离的犬细小病毒之间亲缘关系较近。VP2氨基酸序列在第A5G、S297A、D426E位出现了氨基酸突变;在F81细胞上传3代后,病毒液的血凝效价稳定于210。本研究可为犬细小病毒的流行情况及新疫苗的研究提供参考依据。

毛皮动物新冠病毒监测简报

2019新型冠状病毒病(COVID-19)给公共卫生安全带来巨大危害,但目前引起该病的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)来源还未有定论。现有证据显示,SARS-CoV-2与分离自蝙蝠和穿山甲的SARS-CoV-2病毒株同源性相近,表明蝙蝠和穿山甲可能作为SARS-CoV-2的中间宿主存在。目前,丹麦、荷兰和美国等国家已有人工饲养水貂及饲养场工作人员感染SARS-CoV-2的报道。试验研究显示,SARS-CoV-2可在雪貂上呼吸道复制,且雪貂对SARS-CoV-2高度易感,表明雪貂可作为一种SARS-CoV-2感染和传播的动物模型。2020年2—7月,本课题组对山东、吉林、辽宁、黑龙江等毛皮动物主要养殖省份的水貂样品进行SARS-CoV-2病原及抗体监测。利用WHO推荐的real-time RT-PCR检测方法,对328份水貂内脏组织及咽拭子样品进行检测,结果所有样品均为SARS-CoV-2阴性;采用北京万泰生物药业有限公司提供的SARS-CoV-2抗体检测ELISA试剂盒,对35份水貂血清样品进行抗体检测,结果样品中抗SARS-CoV-2抗体均为阴性。由于国内养殖多为密集型庭院养殖,养殖人员与水貂密切接触,且国外已有养殖场水貂大规模感染SARS-CoV-2的先例,为保障毛皮动物行业健康发展,此次监测重点对我国北方地区毛皮动物养殖场进行采样,结果并未发现毛皮动物携带SARS-CoV-2和针对SARS-CoV-2的抗体。这可能与目前我国人群的低SARS-CoV-2感染率和未有养殖场工人感染有关。本实验室已建立了检测毛皮动物及宠物的SARS-CoV-2抗原及抗体检测方法,在目前全球COVID-19疫情的严峻形势下,未来仍需对毛皮动物及宠物进行长期的SARS-CoV-2流行病学监测。

一株犬瘟热病毒H基因T193I突变株的分离鉴定及序列分析

为对吉林省地区犬瘟热病毒(CDV)流行发病情况调查,本研究从吉林省长春市、吉林市、四平市的养犬场、毛皮动物养殖场、宠物医院共收集12份经胶体金试纸条检测为CDV阳性的肺部样品,利用Vero/DogSLAM细胞进行病毒分离培养,并对分离的病毒经PCR鉴定、间接免疫荧光试验确定该病的致病病原,并对该病毒分型鉴定和H基因的遗传进化分析,并且选取1株犬源CDV病毒感染6只2~3月龄的幼犬进行动物回归试验,每天观察试验犬的临床症状、测量体温、采集眼鼻、肛拭子,拭子经PCR检测CDV的粪便排毒情况。结果显示,有1株犬源样品在Vero/DogSLAM细胞上盲传第4代出现明显的CPE,毒价达104.56 TCID50/mL,经PCR鉴定结果表明分离出1株犬源CDV,命名MHK-04;病毒的分型鉴定结果表明,分离的MHK-04为Asia-I型;对MHK-04毒株的H基因的同源性分析结果表明,MHK-04株为Asia-I型,与广东分离株GD1818株的同源性最高,与疫苗株(Onderstepoort和CDV3)差异较大,核苷酸同源率均为90.1%,氨基酸同源率分别为90.0%和90.1%;经SWISS-MODEL预测H蛋白三维立体模型结果表明,MHK-04株H蛋白氨基酸序列T193I突变位点,位于H蛋白的外部结构中β6S4位,是其起始位点,推测T193I点突变与H蛋白的构像改变及SLAM受体亲和力有关,有待进一步验证;动物回归试验结果显示,MHK-04毒株在感染幼犬后,幼犬出现犬瘟热发病症状,体温在第4 d升高到41.4℃,并出现排毒现象。本研究为了解吉林地区CDV的流行规律及疾病的诊断、防治提供参考。

狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗免疫效果评价

狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病是当前危害养犬业的三种重要传染病。为探讨狂犬病毒(RABV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)灭活制备三联灭活疫苗的可行性,将该3种病毒HEP-Flury株、LN(10)1株和JL(18)1-Beagle株分别在BHK-21、Vero/DogSLAM(VDS)和F81细胞培养,经β-丙内酯灭活剂灭活后,分别与三种不同类型免疫佐剂(MONTANIDE GEL 02、ADJ-801(W)、Al(OH)3)配制成三联灭活疫苗。疫苗经三次免疫比格犬后,通过测定动物血清抗体水平和攻毒保护情况评价其免疫效果。实验结果显示,不同佐剂的三联灭活疫苗对增强比格犬RABV、CDV和CPV血清抗体应答反应效果不同。其中ADJ-801(W)佐剂能显著提高针对RABV、CDV和CPV三种病毒的抗体水平,疫苗三次免疫比格犬后血清抗体效价分别为7.4 EU/mL、1∶50和1∶1024;而Al(OH)3佐剂效果较差,三免后抗体效价分别为4.01 EU/mL、1∶6和1∶256。疫苗三次免疫后,分别应用强毒CDV SD(14)7株和CPVJL(18)1-Beagle株对比格犬进行攻毒实验,实验结果显示,ADJ-801(W)组对SD(14)7和JL(18)1-Beagle攻毒保护率均为100%,MONTANIDE GEL 02组攻毒保护率均为60%,而Al(OH)3组攻毒保护率均为0,表明ADJ-801(W)佐剂制备的狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗对比格犬提供较好的免疫保护作用。本研究为犬狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗的研制奠定了基础。

纳米抗体及其在动物传染病防控中的应用

纳米抗体是存在于骆驼科外周血中的一种天然缺失轻链的重链抗体可变区结构域,因其特殊的结构特点具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性强、易于可溶性重组表达等优点,近年来在轮状病毒、流感病毒、新型冠状病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、狂犬病病毒、金黄色葡萄球菌以及沙门菌等传染性病原体的诊断与治疗中取得了较好的应用效果。现主要介绍纳米抗体的结构与特点、制备与表达技术,在传染病诊断与治疗中的应用研究现状与发展趋势,以及优缺点,为传染病的防控技术提供参考。

水貂肺炎克雷伯菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】肺炎克雷伯菌是人畜共患的条件致病菌,是引起水貂肺炎的常见病原菌之一。试验主要对吉林省某水貂养殖场送检的6只患有肺炎的病死水貂进行细菌分离鉴定及耐药性分析,为指导临床合理用药提供依据。【方法】通过分离纯化方法从样品中分离菌株并进行PCR鉴定,应用多位点序列分型技术(MLST)进行菌株ST分型。通过感染小鼠了解菌株的致病性,PCR检测血清型及毒力基因的携带情况;运用琼脂稀释法检测分离菌株对18种药物的敏感性,并通过PCR检测分离菌株耐药基因的携带情况。【结果】分离得到的6株菌株经PCR鉴定为肺炎克雷伯菌;MLST分析结果表明6株菌株分别有6种ST型,分别为:ST2594、ST1782、ST2844、ST2330、ST86和ST661。致病性分析结果显示,6株菌株均可引起小鼠死亡,共检测出6种毒力基因,未检测到毒力较强的血清型。药敏试验结果显示,6株肺炎克雷伯菌对头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星较敏感,对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、青霉素、氨苄西林、环丙沙星、恩诺沙星、左氧氟沙星、多西环素和氟苯尼考较耐药。耐药基因检测结果显示,6株菌株共检测出bla_(SHV)、bla_(TEM-1)、bla_(CTX-M-1G)、aadA1、aac(3’)-Ⅳ、aac(3’)-Ⅱc、aph(4’)-Ⅰa、aph(3’)-Ⅶ、aph(3’)-Ⅳ、aph(2’)-Ⅰb、rmtB、qnrB、qnrD、qnrS、qepA、oqxAB、floR和mcr-118种耐药基因。【结论】分离到的6株肺炎克雷伯菌株为不同的种系进化,并具有较强的致病性和耐药性,为临床用药治疗带来困难。

水貂细小病毒VP2基因的可溶性表达优化及包涵体蛋白复性研究

为探究水貂细小病毒(MEV)VP2蛋白的结构和功能,对MEV VP2蛋白进行原核表达并纯化,用ELISA初步评价重组蛋白在血清学诊断中的价值。通过大肠埃希菌表达外源基因的方法构建MEV VP2原核表达体系,经诱导表达得到以包涵体形式存在的目的蛋白,对蛋白进行纯化、透析复性并鉴定;加入分子伴侣pTf16质粒构建共表达系统,优化表达条件以提升可溶性目的蛋白的表达量,对表达产物进行纯化及鉴定。将纯化后的可溶性蛋白、复性后的包涵体蛋白及纯化后的全病毒蛋白作为抗原包被酶标板,用间接ELISA方法对MEV标准阴、阳性血清进行检测,初步对比评价3种抗原的血清学诊断价值。结果表明,经过双酶切和测序鉴定,成功构建重组蛋白原核表达载体;重组VP2蛋白的分子质量约为67 ku;优化诱导温度和诱导试剂浓度未能解决包涵体表达问题;构建了共表达系统,优化表达条件后可溶性目的蛋白的表达量得到明显提高;SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明,两种重组蛋白皆具有良好的反应原性;间接ELISA结果表明可溶性表达蛋白更适合作为MEV的候选诊断抗原。通过分子伴侣共表达和包涵体蛋白复性的方法获得了大量有活性的目的蛋白,为建立水貂细小病毒血清学诊断方法和制备MEV病毒样颗粒(VLPs)及VP2蛋白多克隆抗体奠定了基础。

水貂出血性肺炎大肠杆菌毒力基因测定和H基因分型

为了分离鉴定引起水貂出血性肺炎的大肠杆菌,并对其致病性、血清型和毒力基因进行鉴定。本研究主要通过细菌分离鉴定试验对具有典型肺炎症状的死亡水貂的病原体进行分离,利用16S rRNA对进行细菌鉴定,并通过PCR方法对分离细菌的血清型和毒力基因进行检测,分析分离菌对动物的致病性。结果显示:28例水貂肺炎病例中分离出8株大肠杆菌,分离率为26.6%;H血清型分析显示:8株大肠杆菌的H基因型分别为H5、H11、H16、H25,其中H11为主要基因型,比率为50%(4/8);共有4种大肠杆菌的主要毒力基因,分别是iutA、papC、irp2、fyuA,其中H11血清型菌株含有iutA、irp2和fyuA 3种主要毒力基因。通过本研究我们明确了引起水貂肺炎的大肠杆菌主要血清型为H11,主要的毒力基因为iutA、papC、irp2和fyuA。

犬细小病毒与宿主互作及跨种传播机制研究概况

犬细小病毒(CPV)作为一种有着详细信息记载的病毒,一直以来是研究病毒遗传进化和跨种属传播机制的理想的模式病毒。研究表明,点突变CPV VP2蛋白第300位氨基酸残基即可改变CPV的宿主范围,论文通过对CPV病原学、CPV与其宿主细胞相互作用和突破种间屏障机制等方面进行综述,为进一步阐明CPV跨种传播机制等问题奠定基础。

犬瘟热病毒N和H蛋白拮抗IFN-β信号通路的研究

为研究犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)不同毒株N、H蛋白调控宿主β-干扰素(IFN-β)表达的作用,将CDV野毒株LN(10)1、SD(14)7和疫苗株CDV3感染提前转染了pGL3-IFN-β报告基因质粒和pRL-TK内参质粒的MDCK细胞,分别在感染0 h、8 h、12 h和24 h后通过双荧光素酶报告系统检测试剂盒测定IFN-β启动子的活性。将CDV野毒株LN(10)1、SD(14)7和疫苗株CDV3 N和H基因克隆到pCI真核表达载体。重组表达质粒分别转染HEK293T细胞,应用Western blot检测蛋白能否正确表达。将N和H蛋白重组表达质粒连同pGL3-IFN-β报告基因质粒和pRL-TK内参质粒共转染至HEK293T细胞后,经Poly(I:C)刺激细胞,利用双荧光素酶报告系统检测系统测定IFN-β启动子活性。结果显示3种不同毒力的CDV在感染MDCK细胞后,只有CDV 3疫苗株感染后能观察到IFN-β启动子短暂激活。Western blot实验证实,3种毒株N和H蛋白在HEK293T细胞中均能正确表达。双荧光素酶报告系统对IFN-β启动子检测活性结果显示,Poly(I:C)成功激活了IFN-β信号通路,而这种激活作用在表达CDV不同毒株的N或H蛋白时均受到显著抑制(P <0.01),但不同毒株N或H蛋白对IFN-β信号通路的调控与CDV毒力无关。本研究证实了CDV野毒株和疫苗株N、H蛋白可抑制宿主IFN-β信号通路,为进一步研究CDV与宿主分子互作奠定基础。

ADV VP2主要抗原表位基因核酸疫苗与IL-12、IFN-γ细胞因子佐剂质粒的构建及鉴定

为研制安全有效的水貂阿留申病毒(ADV)VP2核酸疫苗,本研究构建了不含有形成抗原抗体复合物表位的VP2核酸疫苗以及IL-12、IFN-γ细胞因子真核表达质粒,在体外细胞水平鉴定上述目的基因的表达情况。首先,以各克隆质粒为模板,PCR扩增获得ADV的VP2主要抗原表位M、鼠IL-12和IFN-γ的基因片段,连接至pVAX1载体,经酶切及测序鉴定后,确定构建正确;其次,将真核表达质粒转染入293T细胞,通过间接免疫荧光及Western Blot分析表达情况。结果显示:pVAX1-M可正常表达,并且目的蛋白可与ADV阳性血清结合,具有良好的反应原性。含细胞因子的真核表达质粒pVAX1-IL及pVAX1-IF转染293T细胞后,通过间接免疫荧光、Western Blot及ELISA分析证明,目的蛋白可在体外正常表达,且具有生物学活性。本研究可为水貂阿留申病核酸疫苗深入研究奠定基础。

猪流行性腹泻病毒血清中特异性IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在开发和优化新型间接ELISA,使其成为一种简单、快速、灵敏、特异的检测抗PEDV抗体的方法,并评价其作为诊断PED方法的有效性。以Vero细胞培养全病毒抗原(LNCT2株)间接ELISA检测方法为基础,以中和试验(NT)为参照,通过受试者工作特征曲线(ROC)分析,确定截断值为0.320,敏感性为92.6,特异性为90.1%。曲线下面积(AUC)为0.949,说明间接ELISA检测具有较好的准确性。间接ELISA与中和试验呈正相关(R=0.815,P<0.05)。此外,kappa静校正结果也显示出良好的一致性。抗原包被保存板干燥后不同时间(1 d、2 W、1、2、3、4、5、6个月)的敏感性和特异性分别为100%和80%~100%。本研究开发的间接ELISA检测可作为PEDV感染的血清学调查和疾病控制的可靠检测手段,且我们的抗原包被ELISA板可在4℃保存至少6个月。

水貂病毒性肠炎和水貂犬瘟热研究进展

水貂细小病毒(Mink enteritis virus,MEV)和水貂犬瘟热病毒(Canine distemper virus)是威胁水貂健康的常见病原,分别引起水貂病毒性肠炎和水貂犬瘟热2种传染病,这2种传染病都是急性、高度接触性传染病,虽然接种合格的疫苗是有效的防控手段,但是病毒基因的变异、跨物种间传播、跨地区地域传播以及不同地域病毒之间出现的重组等因素,都可导致免疫失败,病毒一旦在群体间流行并传播,动物感染后仍会出现极高的发病率和死亡率。水貂细小病毒和水貂犬瘟热病毒给毛皮动物养殖业以及野生珍稀动物的保护带来的影响和危害,应适当予以重视。该文综述MEV和CDV的病原学和致病机理、流行病学和分子生物学、实验室诊断方法以及疫苗研究。

猪A组轮状病毒VP7基因的克隆及生物信息学分析

为了研究猪A组轮状病毒VP7基因功能,根据GenBank中猪轮状病毒VP7基因DNA序列设计引物,以实验室轮状病毒上海分离株SH-1为模板,进行PCR扩增,将VP7基因克隆到pMD-18T载体后,进行序列测定及分析。结果表明:此序列编码326个氨基酸,其相对分子量为37.38 Ku,理论等电点(PI)为4.77。VP7蛋白以α螺旋为主,主要有13个抗原表位区域。系统进化树分析显示分离株SH-1与KM230930.1株亲缘关系最近,基因型分析结果是G10型,属于人兽共患病毒株。

应用高通量成像技术检测猪流行性腹泻病毒中和抗体

使用已知感染了猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的猪(n=159)的血清样本比较了高通量中和试验(high-throughput neutralization assay,HTNT)与荧光聚焦中和(fluorescent focus neutralization,FFN)试验,评价了基于PEDV成像细胞术的HTNT的性能。结果发现,经受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析得出的HTNT和FFN检测的诊断灵敏度和特异性估计值显示,PEDV FFN和HTNT均提供了极好的诊断性能。成像细胞计数提供了一种客观和半自动的方法,从检测过程中去除人的主观性,并将96孔板的读取时间缩短至不足4 min。

狂犬病颗粒样疫苗的制备及免疫评价

为研发高免疫原性的新型狂犬病颗粒样疫苗,利用PCR方法扩增狂犬病病毒HEP-Flury株的G蛋白和M蛋白基因序列,将其依次克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统穿梭载体pFastBac dual上,构建重组质粒pFD-GM。制备基于pFD-GM的重组杆粒,转染至Sf9细胞,得到重组杆状病毒rb-GM,在Sf-9细胞中表达获得病毒样颗粒VLP-GM。经SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光鉴定,重组杆状病毒成功表达了G蛋白(约56 kDa)和M蛋白(约23 kDa);经电镜观察,VLP-GM大小约为100 nm×50 nm,呈表面带有纤突的子弹形状,与典型的狂犬病病毒粒子类似。将VLP-GM免疫犬,经测定犬在二次免疫后产生较灭活疫苗更高的中和抗体水平,达到7.81 U/mL,并且与单独免疫G蛋白相比可刺激更多细胞因子如白细胞介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)生成。本研究成功表达了狂犬病病毒的病毒样颗粒VLP-GM,证明了其免疫原性,为后续的疫苗研制和抗体制备奠定了基础。

犬细小病毒疫苗的研究进展

犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)是引起的犬腹泻是导致犬类死亡的高度接触性传染病病原之一。针对这种疫病目前最为有效的防控方法就是疫苗接种,然而由于多种因素的影响如病毒变异、母源抗体干扰等因素导致的免疫后感染发生率仍然较高。目前已应用的传统疫苗如灭活疫苗或弱毒疫苗具有其不足之处,开发新型疫苗提高免疫效力是较为有效的防控措施。因此,现从细小病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程亚单位疫苗及核酸疫苗等角度介绍CPV疫苗的研究进展,为细小病毒防控产品的研制提供借鉴。

犬冠状病毒诊断技术研究进展

犬冠状病毒(canine coronavirus,CCoV)属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)、α冠状病毒属成员。近几年,冠状病毒感染犬的比例正在不断上升,加上有研究表明犬也会感染新型冠状病毒,而市场上缺少治疗冠状病毒的特效药物。因此,快速、精确的诊断宠物疫病对该病的防控起到不可或缺的作用。目前,犬冠状病毒常用的检测技术分为临床诊断、病原学检查和血清学检查,但由于冠状病毒病的流行病学特点、临床症状以及病理剖检缺乏特征性变化,据此只能作出初步诊断,病原学检查主要分为病毒分离培养、电镜诊断、PCR、RPA、夹心ELISA和RT-RAA;血清学检查主要分为中和试验、间接ELISA、胶体金免疫层析试纸条。2019年新型冠状病毒感染导致的疫情在全球爆发以来,备受社会各界关注,一些新的变异毒株也在不断出现。因此,亟需一种快速、简便、成本低、灵敏性高、特异性强的诊断方法来监测、预警疫情,为进一步研发特异性疫苗提供参考与帮助。

水貂犬瘟热病毒微滴数字PCR检测方法的建立与应用

为建立检测水貂犬瘟热病毒(mink canine distemper virus,CDV)的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量方法,以便提供水貂CDV在诊断检测方面的技术支持,本研究根据实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法原理,建立了水貂CDV数字PCR方法,并优化了反应条件,评估了特异性、敏感性以及重复性。结果表明:ddPCR方法检测CDV的最适引物浓度为900 nmol/L,探针浓度为250 nmol/L,退火温度为55℃,升降温度为2.5℃/s,最低检测下限为4.4拷贝/μL;除CDV特异性扩增,其他常见病毒特异性检测结果均为阴性;重复性试验的变异系数均小于5%。采用该微滴数字PCR和荧光定量RT-PCR方法对30份犬、貂、狐、貉等组织(其中CDV阳性样品7份)样品进行检测,检测结果与临床检测结果相符。本研究建立的微滴数字PCR方法对CDV定量检测特异性强、灵敏度高,重复性好,可以用于水貂CDV临床样品的核酸检测,对水貂CDV发病早期的诊断提供新的定量检测方法。

犬细小病毒颗粒疫苗的研制与免疫效果评价

犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒(CPV)引起的一种高度传染性疾病,目前最为有效的防控方法为疫苗接种。本研究将CPV VP2基因克隆于pQB3载体中,将鉴定正确的pQB3-VP2重组质粒与qBac-ⅢG杆粒共转染至sf9昆虫细胞中,拯救获得表达CPV VP2蛋白和绿色荧光蛋白的重组杆状病毒rBac-VP2。rBac-VP2感染sf9细胞可出现明显的细胞病变,在荧光显微镜下可见明显的绿色荧光,间接免疫荧光鉴定显示rBac-VP2感染的sf9细胞可见明显的红色荧光。对细胞表达的VP2蛋白进行Western-blot鉴定,结果显示在约65 ku处可见明显的目标蛋白条带,电镜下可见与天然细小病毒形态大小相似的粒子,表明rBac-VP2感染昆虫细胞后可组装形成病毒样颗粒(VLPs),收获的VLPs血凝效价可达1∶210。将CPV VLPs免疫小鼠后诱导机体产生血凝抑制抗体,效价达1∶27,与宠必威幼犬保商业化疫苗产生的免疫效果相当。本研究为犬细小病毒新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。