基于免扩增高通量测序的转基因定量检测方法研究

转基因定量检测在食品安全监管和消费者知情权保障中扮演着重要角色。当前,数字PCR方法被广泛认可为核酸精准定量的黄金标准,但缺乏与之相互验证的新型核酸定量技术,这在一定程度上限制了其应用。然而,近年来高通量测序技术的兴起为解决这一难题提供了新的可能性。尽管高通量测序技术主要用于核酸定性序列测定,但其在核酸定量领域的应用潜力尚未充分挖掘。以含有转基因T-NOS、P-35S、CP4-EPSPS和大豆内标准基因Lectin的质粒DNA标准物质为检测对象,采用免扩增建库的方法,比较了NGS、三代测序以及数字PCR定值的差异。结果表明,NGS测序结果与数字PCR结果存在显著性差异,这一发现突显了目前核酸定量技术中的挑战和需求。然而,值得注意的是,三代测序结果与数字PCR检测结果一致性良好,显示了其作为转基因核酸精准定量方法的潜力。这一发现为未来转基因产品标识阈值的制定提供了技术上的支撑和参考,为食品安全监管提供了新的技术途径。

转基因定量检测结果测量不确定度的自上而下评定方法研究及应用

【目的】定量检测标准体系是实施转基因定量标识的基础,而不确定度评定是定量检测标准体系的重要组成部分。急需建立适合一般实验室采用的标准化转基因定量检测结果不确定度的自上而下评定方法,以便检测实验室自行评定定量检测结果的测量不确定度。【方法】测量方法精密度不确定度评定有2种方法,一种是根据“不确定度函数”的一般概念,利用15个不同浓度的常规样品,建立测量方法精密度引入的不确定度评定公式;另一种是重复测量有证标准物质,根据检测数据的中间精密度,计算方法精密度引入的不确定度。用有证标准物质或实验室配制样品作阳性定量质控品进行偏倚不确定度评定,实验室配制样品标称值的不确定度由实验室根据制备过程采用简易程序自行评定。将测量方法精密度引入的不确定度和测量过程的偏倚不确定度合成,评定试样定量结果的标准不确定度,然后乘以包含因子k,获得扩展不确定度。【结果】以转基因玉米DBN9936定量检测方法为例,分别用模拟的DBN9936常规样品和有证基体标准物质(GBW(E)100901)评定测量方法精密度引入的不确定度,分别为0.76%和0.33%,与常规样品相比,用有证标准物质评定的测量方法精密度不确定度显著偏小。用有证标准物质(GBW(E)100901)评定的偏倚不确定度为0.26%;用实验室配制粉末样品和基因组DNA样品(标称值均为3.0%)评定的偏倚不确定度分别为0.20%和0.19%。采用简易程序评定实验室配制样品标称值引入的不确定度时,部分不确定度分量被忽略,评定的偏倚不确定度偏小。将测量方法精密度不确定度和偏倚不确定度分别合成,用常规样品评定的扩展不确定度为1.26%、1.20%和1.20%;用有证标准物质评定的扩展不确定度为0.84%、0.78%和0.76%。【结论】建立了转基因定量检测结果自上而下的不确定度评定方法,检测实验室要优先选择用常规样品评定测量方法精密度引入的不确定度。在评定偏倚不确定度时,检测实验室原则上要优先选择有证标准物质作阳性定量质控品。

转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质的研制

【目的】转基因检测标准物质是转基因生物安全监管、标识制度实施的物质基础,是实验室内检测数据溯源、实验室间检测数据可比的保证。中国于2017年批准进口转基因玉米MON87427用作加工原料,其安全监管和检测急需研制有证标准物质。【方法】以开发商提供的转基因玉米MON87427杂合种子和非转基因受体种子为原材料,对转基因玉米MON87427和其受体种子分别清洗、干燥、冷冻研磨、粒径及含水量检测,按质量分数(以干基计)称量配制得到质量分数分别为60.0、99.5和1000.0 mg·g^(-1)的转基因玉米MON87427基体标准物质MON87427a、MON87427b和MON87427c。运用实时荧光定量PCR进行粉末的均匀性初检,初检合格后分装。用MON87427/zSSIIb二重微滴数字PCR(ddPCR)方法进行标准物质均匀性、稳定性评估和8家实验室联合定值。根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF 1343)进行标准物质均匀性评估、稳定性评估、联合定值数据的处理及不确定度评定。【结果】本批标准物质有MON87427a、MON87427b、MON87427c 3个浓度,粒径小于200μm的粉末大于80%,含水量低于5%。用棕色玻璃瓶分装,不低于1.0 g/瓶,充氮后轧盖,3个浓度的标准物质各分装400瓶。3种标准物质均匀性检验的F值均小于临界值F0.05(14,30)(2.04),在瓶内和瓶间具有良好的均匀性,使用时,最小取样量为100 mg。标准物质在25℃、37℃和60℃条件下可稳定储存14 d,表明在常温下运输14 d标准物质特性量值不发生趋势性变化;在4℃和-20℃条件下长期稳定性达到12个月;开盖取样5次,标准物质特性量值未发生显著偏离。8家实验室联合测定的标准物质拷贝数比值无异常值、呈正态分布、且等精度,标准物质MON87427a、MON87427b、MON87427c的标准值及扩展不确定度分别为(2.92±0.44)%、(4.89±0.57)%、(52.1±3.4)%。【结论】研制的转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质均匀性良好,可稳定运输和储存,满足转基因玉米MON87427定性、定量检测需求,为转基因玉米MON87427的安全监管、定量标识制度的实施提供了可靠的有证标准物质。

羊源性基因组DNA标准物质研制

近年来,羊肉及其肉制品的掺假等食品安全事件层出不穷,为了完善市场执法检查法律依据,利用数字PCR定值羊HELZ基因,研制了羊基因组DNA标准物质。由于标准物质可以用于衡量检测方法的准确性,因此可以判定食品及相关制品中羊肉的掺假情况。利用数字PCR对研制的标准物质进行均匀性和稳定性评估,结果表明该批标准物质均匀性良好,在4℃、25℃可以稳定保存14 d,在-20℃可以稳定保存6个月。来自全国9个不同实验室羊源性基因组DNA标准物质(高浓度)和羊源性基因组DNA标准物质(低浓度)的联合定值结果显示,标准值及其扩展不确定度分别为(5.44±0.45)×10^(3)copies·μL^(-1)和(5.68±0.54)×10^(2)copies·μL^(-1)。该羊源性基因组DNA标准物质为动物源性标准物质的市场应用提供了技术基础,完善了羊源性基因组DNA标准物质的制备、定量检测、质量控制和量值溯源技术平台。

昆虫抗白僵菌免疫应答及其在害虫防治中的应用潜力

昆虫病原真菌白僵菌能成功侵染多种昆虫寄主并致其死亡,是农业生产中有效的生物杀虫剂。相应地,昆虫依赖多种策略抵御真菌感染,其中先天免疫防御是对抗真菌感染的重要手段。昆虫表皮是抵御真菌入侵的第一道屏障,表皮和外分泌腺可分泌多种抑菌化合物降低真菌毒力,当真菌孢子进入血淋巴后,细胞免疫和体液免疫共同作用产生系统性免疫应答,表达的多种防御效应因子在细胞包囊、细胞凋亡、黑化反应中发挥功能。然而昆虫强烈的免疫反应影响田间施用白僵菌的效果,导致该真菌制剂应用的局限性。文章详细阐述昆虫感染白僵菌后的免疫应答机制,参与抗真菌免疫的基因与作用手段。该研究为了解昆虫抗真菌免疫机制提供了详实的基础,为合理改造白僵菌、有效提高白僵菌毒力水平提供坚实基础,为农业虫害治理提供新的策略。

利用单壁碳纳米管介导植物瞬时遗传转化的研究

为验证单壁碳纳米管(SWNT)介导的新型的植物遗传转化方法的有效性,利用羧基化的单壁碳纳米管(COOH-SWNT)为原材料,构建了聚乙烯亚胺(PEI)修饰的羧基化单壁碳纳米管复合物(PEI-SWNT),探索验证PEI-SWNT复合物对外源基因的结合比例以及保护作用,使用PEI-SWNT复合物将RED以及UBQ10-EGFP等荧光质粒转化到油菜的原生质体和烟草叶片中。结果表明,PEI-SWNT纳米材料成功与外源目的基因结合,并对外源目的基因进行保护,使其免于核酸酶的降解,PEI-SWNT携带目的基因进入受体细胞后,可以成功地在受体细胞内进行基因表达。

抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性定性PCR检测方法的建立及其标准化

抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5已经批准获得我国进口用作加工原料的安全证书,含有外源HaHB4基因和bar标记基因。本研究根据抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体5′端和3′端插入位点旁侧序列信息,设计19对引物,结合罗萨里奥农业生物技术学院公司的1对引物,针对20对引物组合利用定性PCR技术进行引物特异性筛选,结果显示5′端的14号引物特异性良好,优化后获得最佳反应体系和反应程序;经测试,该引物特异性好、稳定性高,检出限达0.1%,扩增片段大小248 bp。经8家有资质实验室对本方法的特异性、检出限、重复性和再现性进行验证,各项参数均达到国家标准要求。本研究成功建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体定性PCR检测方法,为IND-ØØ41Ø-5转化体在国内的安全监管提供技术支撑。

基于重组酶聚合酶扩增技术的牛源性成分快速检测方法

市场中肉类食品掺假的复杂多样化使得监管机构对动物源性成分鉴定的便捷性、准确性、灵敏性要求越来越高。尤其是市场上经济价值较高的牛肉类产品已成为制假的重灾区,迫切需要建立一种快速、高效的牛源性成分分子检测方法。基于此,以牛组成型表达基因β-actin为靶基因设计并筛选了几组牛特异性扩增的引物和探针组合,经过灵敏度检测和特异性验证,建立了一种牛源性成分实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)快速检测方法。通过优化试剂配比,提高了一步法提取牛肉制品DNA的效率,同时将PRA技术与胶体金免疫试纸条显色技术相结合实现了检测的便捷化和结果的可视化。实际应用结果表明,研究建立的牛源性RPA检测方法能够特异性地检测牛源性成分,且最低检测灵敏度可达到14.8个拷贝,通过胶体金免疫试纸条得到的可视化结果的准确性和灵敏度与实时荧光RPA相同。该方法特异性强、灵敏度高,整个过程在25 min内即可完成,极大缩短了检测时间。

龙葵碱检测技术研究进展

龙葵碱是一种糖苷生物碱,存在于茄科、百合科和菊科植物中,多见于马铃薯组织的幼嫩和损伤处,主要以α-茄碱和α-卡茄碱两种形式存在。龙葵碱对于植物抵御病虫害有着重要意义,但作为存在于马铃薯中的主要毒素,龙葵碱的含量关乎食品安全和人体健康,因此研究龙葵碱检测技术非常必要。本文对龙葵碱的来源、结构及理化性质、提取方法等进行了阐述,概括了龙葵碱检测技术的研究进展,以期为研究马铃薯及其制品的食用安全性提供参考。

抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性定量PCR检测方法的建立及其标准化

【目的】抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5已获得中国进口加工原料安全证书,建立一种特异、准确、灵敏的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,为抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5在中国的安全监管提供精准测量技术。【方法】首先利用Beacon designer 8.0软件对抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体5′端旁侧序列设计18对引物探针,结合1对罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的引物探针,随后采用qPCR技术对引物探针进行特异性筛选,遴选出1对候选引物探针;设置实时荧光定量PCR的引物/探针浓度梯度,优化qPCR方法的反应体系;设置不同类型的特异性测试样品测试方法的特异性;以纯合抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5基因组DNA作为标准样品,梯度稀释成标准溶液模板,绘制标准曲线,考察qPCR方法的线性动态范围,配置拷贝数比值为5%、1%和0.1%的测试样品,评价定量方法的准确性;配置拷贝数比值为0.05%和0.025%的样品,测试方法的检出限;拷贝数比值为0.1%的样品经16次定量测试,确定方法的定量限;最终确定抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法的关键技术参数。8家有资质单位对该定量PCR方法的特异性、检出限、定量限、准确性等进行验证,采用柯克伦法和格拉布斯法评估qPCR方法的重复性和再现性,利用线性最小二乘法对准确性样品测试结果的测量不确定度进行预评定。【结果】通过特异性筛查确定RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1引物探针为候选组合,建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性qPCR方法,扩增片段为138 bp,优化的反应体系引物终浓度为0.4μmol·L-1、探针终浓度为0.2μmol·L-1;IND-ØØ41Ø-5和Lectin标准曲线的线性动力学范围为33—83190 copies的基因组DNA,该方法可准确定量5%、1%和0.1%含量的IND-ØØ41Ø-5测试样品,偏差和相对标准偏差(RSD)均小于25%;确定检出限为0.05%、定量限为0.1%。8家实验室间联合验证该方法稳定性好、特异性强,检出限为0.05%,定量限为0.1%,且具备良好的实验室间重复性和再现性,经测量不确定度预评定后,获得5份抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5测试样品的测量结果分别为(0.10±0.02)%、(0.53±0.09)%、(1.05±0.18)%、(2.05±0.34)%和(5.18±0.87)%,结果准确可靠。【结论】成功建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法,能够实现抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体成分的精准定量检测。