新城疫病毒V和W基因真核表达产物对DF-1细胞凋亡的影响

将含新城疫病毒（NDV）疫苗株LaSota和强毒株GM V和W基因的真核表达质粒pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V和pEGFP-GM W转染鸡胚成纤维细胞（DF-1）。转染24h后，用荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP在细胞中显著表达。分别于转染后24、36h和48h用流式细胞仪测定表达产物对DF-1细胞凋亡的影响。结果表明，随着转染时间的增加，细胞早期凋亡率逐渐上升。在质粒转染后24h ， pEGFP-GM V、pEGFP-GM W、pEGFP-La V和pEGFP-La W真核表达产物诱导DF-1细胞的凋亡率在14 T.26％～17.09％之间，差异不大，但都明显高于空载体组。而在质粒转染后36h ，pEGFP-GM V、pEGFP-GM W真核表达产物诱导细胞凋亡率分别为45.05％和43.4％，明显高于pEGFP-La V 和pEG-FP-La W诱导的31.44％和38.64％的凋亡率。在质粒转染后48h ，pEGFP-GM W和pEGFP-La W真核表达产物诱导细胞凋亡率均超过50％， pEGFP-GM W 真核表达产物诱导细胞凋亡率达到了43.4％，而pEGFP-La V真核表达产物诱导细胞凋亡率最低，为33.44％。由此表明，来源于不同毒力 NDV毒株非结构蛋白V和W均能诱导早期细胞凋亡，但是诱导细胞凋亡能力存在一定的差异。

新城疫病毒V和W基因在DF-1细胞中的真核表达

采用2轮PCR扩增获得新城疫病毒疫苗株LaSota和强毒株GM V和W基因全长,分别克隆到pMD19-T载体上,然后亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1,重组质粒经过酶切,PCR鉴定及测序,筛选出阳性重组质粒,分别命名为pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V和pEGFP-GM W。将各重组质粒分别转染到DF-1细胞,于转染后12、24h和36h在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP在细胞中的表达情况。结果显示,各质粒转染DF-1细胞后在12h就可以见到绿色荧光蛋白,随着时间的延长,绿色荧光蛋白荧光强度增加,到36h后达到最强,而对照组始终没有见到GFP蛋白的表达,表明在转染的阳性细胞中融合蛋白pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V和pEGFP-GM W均能够有效的表达,该结果为新城疫病毒V和W基因的功能研究奠定了基础。