猪伪狂犬病病毒天津变异株R13139对猪的致病性研究

为了解猪伪狂犬病病毒(PRV)变异株R13139株对猪的致病性情况,本试验将PRV R13139株和PRV经典强毒株SC株均以10~6 TCID_(50)剂量经滴鼻途径接种6和9周龄健康仔猪各3头,空白对照组鼻腔接种生理盐水,通过攻毒后两个年龄段猪的临床症状表现、眼观病例变化、显微病理变化、抗体产生情况及病毒在体内部分情况评定两毒株对猪的致病力差异。结果显示,SC株对6和9周龄猪的致死率分别为66.7%(2/3)和100.0%(3/3),而R13139株对6和9周龄猪的致死率分别为33.3%(1/3)和66.7%(2/3),表明R13139株对猪的致死性弱于SC株,但R13139株引起两个年龄段猪发病时间比SC株早,同时间段的体温升高幅度更高,神经发症状更严重;眼观病理变化发现,R13139株引起的发病猪肝脏坏死现象比SC株更明显,而心脏、肺脏、脾脏、膀胱和脑的病理变化差异不明显;显微病理结果显示,R13139株对病猪的扁桃体、肺脏、肝脏和三叉神经节等组织造成的病理损伤明显强于SC株;PCR结果显示,R13139株在濒死猪扁桃体、脾脏、肺脏、三叉神经节和淋巴节(腹股沟、肠系膜和颌下)等组织脏器中分布比SC株更广泛;应用ELISA检测攻毒猪抗体发现,R13139株诱导PRV-gB抗体产生的时间比SC株早1d。本研究结果可为揭示中国伪狂犬病重新流行的原因及进一步开展防控技术研究提供科学依据。

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速有效检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的方法,本研究根据FAdV-4五邻体(Penton)基因序列,设计合成1对特异性引物,经过条件优化,建立了检测FAdV-4的纳米PCR方法(Nano PCR)。特异性试验结果显示,该方法对鸡新城疫病毒等12种家禽常见病原及国内报导的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11等5个主要血清型病毒的扩增结果均为阴性,仅FAdV-4检测结果为阳性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对FAdV-4的最低核酸检出量为54.0拷贝/μL,较常规PCR方法高10倍,敏感性较高。应用该方法和病毒分离培养法同时对87份临床样品进行检测,二者均检出14份阳性样品,总体符合率为100%。以上结果表明本研究建立的Nano PCR方法特异性好、敏感性高,可以用于FAdV-4的临床检测和分子流行病学调查。

猪伪狂犬病病毒PCR-LFD检测方法的建立及应用

旨在将PCR技术与可视化的横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立猪伪狂犬病病毒野毒株的PCR-LFD快速检测技术。依据猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计2条特异性引物和对应的特异性探针,其中下游引物和探针分别标记了荧光素(FITC)和生物素(Biotin)。通过对PCR退火温度、引物浓度、探针杂交温度的筛选,确定PCR-LFD方法的最佳反应条件,并对其敏感性、特异性和重复性进行检测。结果显示,所建立的检测方法能够特异性的检测出猪伪狂犬病病毒野毒株,与猪伪狂犬病病毒Bartha-K61株、6种对照病毒和3种对照细菌均无交叉反应,其最低检测限为100TCID50/100μL。该方法对同批次和不同批次猪伪狂犬病病毒DNA分别进行5次重复检测,结果完全一致。该方法对50份临床样品进行检测,PCR-LFD方法和病毒分离培养法检测出16份阳性样品,常规PCR检测出14份阳性样品,PCR-LFD方法的敏感性高于PCR,但两者间差异不显著P>0.05。以上结果表明,所建立的方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且不需要琼脂糖凝胶电泳可直接判读结果,适合养殖场、基层实验室的现场检测。

天津地区猪链球菌9型分离株致病性的研究

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌株携带的主要毒力基因、黏附力试验和溶血性试验等,对分离株的致病能力、基因特性、黏附能力和溶血能力等进行了研究。结果显示,8株9型猪链球菌分离株对昆明小鼠的LD50差异较大,最小值6.4×10^6 CFU/mL,最大值为5.7×10^8 CFU/mL;受试菌株中gdh、cps9J、gapdh、fbps、orf2、mrp、sly和ef基因的检出率依次为100.0%、100.0%、62.5%、50.0%、37.5%、0.0%、0.0%和0.0%,分为5种毒力基因型,毒力基因型与菌株对昆明鼠的致病能力无直接关系。8株9型猪链球菌对PK-15细胞均具有黏附作用,黏附能力为1.2×10^3~3.9×10^4CFU/mL,其中CHTJS55菌株最强,CHTJS9-ZL次之,CHTJS72S最弱。溶血性试验结果表明,随着孵育时间的增长,各菌株的溶血能力均增强,且孵育3 h时,CHTJS41菌株的溶血能力最强,CHTJS70菌株最弱。上述研究结果为临床制定合理、有效的猪链球菌病防控措施以及候选疫苗株的筛选提供了参考依据。