肉鸡养殖场以心包积液为特征病例的诊断

自2014年以来,出现了一种以发生于28~35日龄、发病急、病死率高、剖检可见心包积液、肝脏坏死、肾脏肿大、出血为特征的鸡急性传染病的病例。本研究通过其中一例典型病例的病原分离鉴定研究,发现禽腺病毒检测为阳性。进一步通过禽腺病毒的动物回归试验、病理组织切片分析等,结果发现,该病毒可引起鸡出现相似的临床发病特征和病理变化特征。通过对病毒的hexon基因序列及推导的氨基酸序列进行分析,其与血清4型的同源性最高。因此,确定该病的病原为禽腺病毒血清4型,也确认鸡心包积水综合征在我国肉鸡场的发生和流行。

鸡毒支原体和滑液囊支原体四重PCR检测方法的建立

为建立区分MG弱毒疫苗株F株和非F株以及滑液囊支原体的方法,试验通过分析NCBI上公布的MG和MS基因序列,优选合适的基因序列设计合成了MG弱毒疫苗株F株特异性引物、非F株MG通用引物、MG通用引物以及MS通用引物,各引物扩增条带大小分别为750、585、279和421bp,建立了可以区分MG弱毒疫苗株F株与非F株以及滑液囊支原体的PCR检测方法。结果显示:各引物的特异性或通用性良好,检测限度可以达到100fg/μL。研究表明,该试验建立的四重PCR检测方法可用于MG弱毒疫苗株F株与非F株的鉴别诊断以及滑液囊支原体的检测,为该病的净化提供技术支持。

H9亚型禽流感病毒免疫磁珠分离方法初步建立

禽流感病毒（AIV）严重危害世界养禽业,是举世瞩目的重大人畜共患病原,环境中微量病原是潜在的重要传染源,很难进行监测。为了提高畜禽环境中微量病原的监测效率,样品的必要预处理非常重要。制备了粒径约30~100 nm的Fe_3O_4纳米粒子,并利用戊二醛二步法偶联H9-HA单抗和磁珠,偶联效率约为130 mg/g;200μL免疫磁珠（5.6 mg/m L）可分离纯化100μL血凝价为28的AIV-H9。制备的免疫磁珠可以为纯化和富集畜禽生活环境中的微量病原提供便利,结合其他病原检测手段将有助于提高环境中病原的监测效率。

一株不依赖NAD生长的副鸡禽杆菌的分离与鉴定

为研究湖北省内鸡传染性鼻炎病原菌的特性,本研究从湖北恩施某地鸡场疑似传染性鼻炎的病鸡样品中分离获得一株疑似副鸡禽杆菌(APG)的病原菌。通过细菌的分离培养、形态观察、生化试验、革兰氏染色、动物回归试验和PCR等方法对其进行鉴定。结果显示,分离的病原菌具有APG的形态特征和生化特性;16S rRNA序列比对分析与已报道的APG相应序列同源性高于98%;另外,利用特异PCR,分别检测到p250,pA14和pYMH5等3种质粒的特异基因片段;通过培养试验,该分离株能在无NAD的TSB(含鸡血清)中生长。这是国内首次发现无需NAD且同时存在3种质粒的APG。这一的发现警示国内的APG流行情况复杂,应引起畜牧兽医工作者的注意。

信鸽新城疫病毒的分离、鉴定及F基因的进化分析

2014~2016年,湖北、安徽、山东、河北、四川、陕西、天津等地的数家信鸽公棚疑似暴发鸽新城疫,导致大部分信鸽死亡或运动功能障碍,经济损失巨大。通过对病料利用鸡胚病毒分离法进行病毒分离,并结合血凝试验和血凝抑制试验,初步确定病料中均含有新城疫病毒。进一步通过RT-PCR方法对病毒的F基因进行扩增并测序和序列分析,发现分离毒株裂解位点均具有强毒的序列特点。F基因遗传进化分析显示,分离株基因型均为VIb型。研究结果与目前报道的导致信鸽新城疫的病原主要为VIb型一致。本研究将信鸽新城疫的有效防控提供了参考。

湖北省武汉市某门诊犬瘟热病例统计分析

为了解武汉市犬瘟热的流行情况,以华中农业大学动物医院的临床病例为研究对象,应用胶体金试纸条和RT-PCR检测技术,调查了2015年9月至2016年10月间的门诊犬瘟热病例情况。本次调查共对2 967只门诊犬进行了犬瘟热检测,其中检出阳性143只,阳性检出率为4.8%。从时间分布看,该期间大部分月份的犬瘟热检出阳性率在4%~5%之间,但在气温变化大的10月份较高,约为9%。从群间分布看,耐寒的金毛、萨摩耶、哈士奇、阿拉斯加犬以及耐热惧寒的贵宾犬的阳性比例较高,总占比为54.5%;雄性犬阳性数量明显高于雌性犬;发病犬的年龄分布和犬瘟热的流行特点基本一致,以2~4月龄为主。调查发现,疫苗免疫可明显降低犬瘟热的发病率和患病犬体内的病毒含量。本研究结果在一定程度上反映了该病在武汉市的流行特点,并为该病的防治提供了重要的参考资料。

湖北省武汉市某门诊犬细小病毒病病例统计分析

[目的]了解武汉市犬细小病毒病(CPD)的流行情况和特点。[方法]以华中农业大学动物医院门诊为依托,应用胶体金试纸条和PCR检测技术,对2015年9月至2016年9月的犬门诊病例进行调查分析。[结果]共检测门诊犬病例2 728例,检出CPD阳性121例,阳性检出率为4.4%。从时间分布看,该期间大部分月份的阳性检出率在3%~5%之间,2015年10月的最高,2016年6—9月的最低。从群间分布看,阿拉斯加、边牧、哈士奇、比熊、萨摩耶、博美、巴哥等犬种的CPD阳性数量均占该品种就诊犬总数量的10%以上,而拉布拉多、雪纳瑞、德牧、贵宾、金毛犬则在5%以上;雄性犬的CPD阳性检出率明显高于雌性;在阳性病例中,2~4月龄幼犬的占比最高,在40%~60%之间;未免疫或未按规定免疫犬的CPD阳性数量与总阳性数量的占比高达86.7%,而按规定免疫犬仅为13.3%。[结论]CPD的发生与犬的品种、年龄、性别、免疫状况和气候等因素存在一定的关系,尤其是其年龄和免疫状况。本研究有助于了解该病的流行特点,并可为该病的防治提供参考。

鸡毒支原体HS株粘膜免疫抗原VlhA4.12的重组表达及其功能结构预测

为筛选参与呼吸道局部免疫反应的鸡毒支原体(MG)抗原,本研究收集MG-HS株感染鸡的血清和呼吸道冲洗液,并以其为一抗,与MG菌体裂解物进行western blot检测。结果筛选到一个大小约为75 ku的抗原,质谱分析显示与MGR株的血凝素基因家族成员VlhA4.12同源,生物信息学分析显示存在多个B细胞和T细胞抗原表位。重组VlhA4.12中4个色氨酸密码子"TGA"进行同义突变,并在大肠杆菌中进行表达,结果显示表达产物能够与MG感染鸡呼吸道冲洗液中特异性IgA和IgY反应。VlhA4.12的筛选工作为新型MG疫苗抗原筛选提供新思路,也为粘膜免疫亚单位疫苗研制奠定了基础。

猪肝羧酸酯酶1基因的克隆和在原核细胞中的功能性表达

为获得有活性的猪肝羧酸酯酶1(PLE1)并研究其功能,利用RT-PCR与常规PCR方法,从大白猪肝组织中扩增PLE1基因的ORF。将PLE1的ORF序列连接到pET15b原核表达载体,在Origami TM2(DE3)中与pGro7质粒共诱导表达,纯化目的蛋白质并检测其酶活性。测序结果表明克隆到PLE1基因编码区全长1 686bp的片段,该片段编码562个氨基酸。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,PLE1融合蛋白质成功表达,在30℃的培养温度下,IPTG诱导6h后,PLE1重组蛋白质表达量最高,且大部分以可溶性形式存在。酶活性试验结果表明,PLE1融合蛋白质水解底物p-NPA的酶活力为1.24U。研究结果不仅为研究PLE1水解兽药特性提供高纯度的具有原有酶活性的重组蛋白质,也为PLE同工酶家族其他重要成员的活性功能研究提供理论依据和技术手段。

佐剂对IBRVΔgG/ΔTK双基因缺失活疫苗牛体攻毒保护效果的影响

牛传染性鼻气管炎是危害养牛业的一种重要病毒性传染病,疫苗免疫是最主要的防控手段。为研究水性佐剂对牛传染性鼻气管炎TK和gG双基因缺失活疫苗(IBRVΔgG/ΔTK株)的免疫增强作用,将18头1.5~2月龄的奶公犊分成4组,组1~3各5头牛,组4为3头牛。组1滴鼻接种IBRVΔgG/ΔTK疫苗株,组2滴鼻接种IBRVΔgG/ΔTK疫苗株和Gel 01 ST水性佐剂混合物,组3为未免攻毒对照组,组4为不做处理的空白对照组。免疫35 d后,1~3组滴鼻攻击毒力株IBRV HB06株。免疫期间,组1牛体温在正常范围内,有1头牛眼睛和鼻腔出现水样分泌物;组2有1头牛出现一个温次达到40℃,有2头在眼或鼻出现水样分泌物。组1和组2血清特异性抗体和中和抗体水平无显著差异。攻毒后,组1和组2各有1头在第3天体温分别升高一个温次,达到40.25℃和40℃,部分牛眼睛出现水样分泌物;组1鼻腔排毒到第8天,组2中有1头牛在第9天仍检测到排毒;而组3出现流眼泪、鼻分泌物、鼻黏膜出血等临床症状,鼻腔排毒持续到第11天;组1肺部病变与空白对照组(组4)无显著差异,组2略严重于组1,组3表现出明显的肺部病变。按症状分值计算,组1和组2总保护率分别为91.7%和61.41%。参考世界动物卫生组织关于IBRV活疫苗的免疫保护评判标准,组1和组2分别达到100%(5/5)和80%(4/5)保护。综上,此研究所用佐剂未达到预期效果,后期仍需进行更多筛选。

羊源丁酸梭菌HDRyYB1发酵工艺的优化

【目的】目前,国内外鲜有关于羊源丁酸梭菌的报道。本课题选用羊源丁酸梭菌HDRy YB1为研究对象,对其发酵工艺进行优化,为该菌株作为饲料添加剂应用于畜牧业生产奠定基础。【方法】采用Plackett-Burman(PB)试验设计法和响应面法分析并优化显著影响HDRy YB1菌株发酵液中芽胞数的培养基成分。【结果】发酵培养基中的面粉浓度、鱼粉浓度和米粉浓度显著影响发酵液中的芽胞数,优化后的发酵培养基组分(质量体积比)为:面粉3.72%、鱼粉0.90%、米粉3.96%、酵母粉0.60%、Na Cl 0.19%、Mg SO4·7H2O 0.19%、KH2PO4 0.01%、Na HCO3 0.01%、Ca CO3 0.48%;培养参数为:37°C,初始p H为7.2-7.4,瓶装量100/250,接种量3%。在此条件下,HDRy YB1菌株发酵完全(18 h)的芽胞数为1.478×108 CFU/m L,是优化前的2.7倍。【结论】HDRy YB1菌株发酵培养基得到了优化,优化后的培养基可用于后期的扩大发酵试验,验证其在实践生产中的应用价值。

牛传染性鼻气管炎病毒gG iELISA抗体检测方法的建立

为了建立有效鉴别牛传染性鼻气管炎病毒（BoHV-1）gg-／tk-基因缺失疫苗人工免疫和BoHV-1野毒株自然感染的鉴别诊断方法，以BoHV-1gG蛋白为抗原建立了间接ELISA（iELISA）抗体检测方法。根据编码BoHV1gG蛋白的基因序列设计特异性扩增引物，以BoHV1基因组DNA为模板扩增gg基因截短片段，克隆至原核表达载体pGEX-6p-1并进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot分析表明，gg基因在大肠杆菌BL21（DE3）中呈可溶性及包涵体2种形式表达，纯化的gG蛋白具有良好的反应原性。将可溶性gG蛋白纯化后作为包被抗原，建立了BoHV-1gGiELISA抗体检测方法，并优化了各反应条件。使用该方法与商业化试剂盒BoHV-1gE和gB阻断ELIsA进行比较检测，并与其他5种牛常见病原体的阳性血清进行交叉反应检测，同时进行了该方法的重复性试验、保存期试验及消长规律试验；最后使用该方法对临床1031份牛血清进行了检测，血清流行率为83．71%,4（95%CI：81．30％～85．90％）。结果显示，该方法的阴、阳性血清检测的临界值（S／P值）为0．398，与进口试剂盒比较显示该方法具有良好的诊断敏感性和特异性，且本试剂盒可在1：50倍样本稀释下进行检测，而商业化试剂盒是1：1倍样本稀释检测。此外，该方法分析特异性良好，与其他非相关病原体的阳性血清无交叉反应；检测重复性良好；在4℃条件下可保存6个月。该方法在人工感染BoHV～1野毒株和人工免疫BoHv-1gg-／tk-疫苗株20d后可以明显区分疫苗株免疫和野毒株感染。综上所述，本研究成功建立了BoHV-1 gG iELISA抗体检测方法，敏感性和特异性良好，既可以用于有效鉴别疫苗免疫和自然感染，也可作为BoHV-1的血清学诊断方法。

单增李斯特菌胶体金免疫层析试纸条的研制

目的以单增李斯特菌(LM)内化素A蛋白(InlA)单克隆抗体为基础,研制其胶体金免疫层析检测试纸条。方法采用DNAStar软件对LM inlA全长基因编码蛋白进行抗原表位分析,截取部分inlA基因片段构建原核表达质粒,诱导表达和纯化获得重组蛋白。以该蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选高效分泌抗InlA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体;以双抗体夹心的原理研制胶体金免疫层析检测试纸条,并对其特异性、敏感性、稳定性进行评价。结果筛选到2株高效分泌抗InlA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体属于IgG1亚类,小鼠腹水抗体效价为1∶64 000;研制的试纸条可与LM发生阳性反应,而与非LM李斯特菌、链球菌、鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌O157∶H7等食源性致病菌均不发生阳性反应;LM纯培养物敏感性为2.4×105cfu/ml,模拟猪肉样品敏感性为4.0×106cfu/ml;4℃保存期可达16周以上。结论研制的胶体金免疫层析试纸条具有快速、特异、敏感等优点,可以用于样品中LM的快速检测。