肉鸡组织脏器的急性热应激损伤及HSP_(90)的表达

将 30日龄AA肉鸡在 ( 4 0± 1)℃高温中分别持续 2、 3、 5和 10h ,定期剖杀 ,进行临床血液病理学、组织病理学和免疫组织化学检测。结果表明 :在热应激 2～ 5h内 ,受试鸡外周血液中肌酸激酶活性持续升高 (P <0 0 1) ;当热应激持续到 10h时其活性出现降低 ,但仍明显高于对照组 (P <0 0 1)。受试鸡的组织脏器在应激前期损伤较严重 ,热应激 2～ 5h内 ,各主要脏器组织如心肌纤维、肝细胞、肾小管上皮细胞出现颗粒变性和脂肪变性 ,甚至坏死 ;而后期组织细胞的损伤则无明显坏死。提示在热应激持续一定时间后 ,机体可通过自身调节逐渐获得对高热的耐受能力。免疫组化结果显示 ,HSP90 广泛分布在热应激受试鸡脏器组织细胞的胞浆和胞核中 ,尤其在组织的小动脉、毛细血管内皮细胞内呈现强表达。提示血管壁中HSP90 可能通过血管的舒缩而影响组织器官的血液供应。

运输应激猪组织病理性损伤、HSP_(27)的组织分布及其相关性研究

利用组织学、免疫组织化学以及临床血液检测等方法,探讨持续运输应激对育肥出栏猪组织的病理性损伤以及组织损伤与HSP27组织定位之间的相关性。结果表明:运输应激初期(1～2h),反映组织损伤的血液肌酸激酶(CK)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性都显著升高;应激4h时,CK及AST活性有所下降;当应激持续到6h和10h时,CK活性又显著升高。组织病理损伤也呈现出相似的波动变化。免疫组织化学结果显示,随着应激时间的延长,HSP27在组织中的定位没有发生肉眼可见的变化;HSP27主要分布在心肌和肝细胞胞浆中,在背最长肌的细胞浆和细胞核中均呈强阳性表达,在肺脏细支气管的黏膜下层有强阳性表达,在受检组织的血管壁及内皮细胞中也有强阳性表达。

检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的重组N蛋白—乳胶凝集试验的建立

The purified recombinant nuclocapsid protein of PRRSV was used to conjoined with latex, and the conjoined concentration,temperature and time were optimized, a detection method for serum antibodies against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus was established. Some tests for the method’s sensitivity, specificity and stability were confirmed. About 200 serum samples were detected by using the method, and these samples were also detected by recombinant N protein based ELISA and IDEXX ELISA kit. The result showed that the agreement ratio of the recombinant N protein based LAT with other two methods arrived at 93%, 78%, respectively.

鸡舍环境耐药细菌气溶胶及其向环境传播的研究

通过对舍内粪便、空气和舍外环境 (10、5 0、10 0m)中的空气分离到的细菌鉴定 ,包括细菌DNA分子生物学检测及药物敏感实验以及细菌含量统计学分析 ,证明三者之间存在着内在联系 ;舍内环境微生物气溶胶包括耐药细菌通过舍内外气体交换排往鸡舍周围环境 ,舍周边环境在一定范围内受到生物污染。研究显示 ,在粪便、舍内空气、舍外环境 10、5 0、10 0m空气中分离的金黄色葡萄球菌和链球菌 80 %以上对氯霉素(CMP)和对苯唑青霉素 (OXA)耐药 ;粪便和舍内外环境空气中的 80 %以上的大肠杆菌和沙门氏菌对氨苄青霉素 (AMP)、氯霉素 (CMP)、头孢唑啉 (CFZ)均为抑制。证明该鸡舍曾经使用过这些药物治疗或作为添加剂在饲料中添加 ,鸡群产生了耐药细菌菌株 ,并向环境传播。测量数据统计结果指出 ,十里河鸡场鸡舍内环境空气中的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和链球菌与舍外环境中相应菌群含量比较差异显著或极显著 (P <0 .0 5或P <0 .0 1) ,但舍外 10、5 0、10 0m之间的相应菌群比较差异不显著(P >0 .0 5 ) ,这说明鸡舍内环境细菌气溶胶含量产生多 ,含量高 ,菌源强度大 ;另一方面 ,反应了鸡舍内环境微生物气溶胶包括耐药细菌能向舍外环境扩散 ,使舍外环境在一定的范围内受到动物源性生物污染 ,影响范围大于 10 0m?

黄芪多糖对人工感染IBDV雏鸡红细胞免疫功能的影响

将由未免疫接种腔上囊病疫苗鸡的种蛋孵化而来的160只1日龄海兰白雏鸡随机分为A、B、C和D共4组。A组为对照组，B、C和D组于26日龄时按每只0．3mL的剂量用IBDV攻毒。A、B组未用黄芪多糖（APS）处理，C、D组从攻毒当日起连续胸肌注射APS6d，剂量分别为每只鸡5mg和10mg。分别在21、29、32、35、38日龄时心脏采血1～3mL，测定E—C3bRR、E—ICRR、ERER和ERIR。结果显示，雏鸡感染IBDV后可使E-C3bRR和ERER显著降低（P〈0．01）；APS处理组E-C3bRR、E-ICRR、ERER均高于A、B组（P〈0．01），其中D组最高，而ERIR则与A组相似。证实，雏鸡感染IBDV后红细胞免疫功能低下，而APS可显著提高其红细胞免疫功能。

重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体ELISA的研究 Ⅳ.与IDEXXELISA试剂盒及Westernblot的比较

利用重组N蛋白抗原建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的ELISA方法并组装成试剂盒,将试制的3批试剂盒分别与IDEXX生产的试剂盒及Western-blot进行了符合率试验。试验结果表明,所研制的试剂盒与Westernblot的符合率达97.67%以上。对460份临床血清分别用自制的试剂盒和IDEXX公司生产的试剂盒进行检测,其中有37份不相符合,用Westernblot对这37份血清进行验证,有35份血清检测结果与自制的试剂盒检测结果一致。由此表明,自行研制的试剂盒,其特异性和敏感性均能满足目前临床上该疫病的流行病学分析或免疫抗体检测。

非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析.借助计算机软件辅助,对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选,利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg2+、引物、探针浓度等参数进行了优化,其最佳浓度分别为4.5 mmol/L,400 nmol/L和500 nmol/L.同时,对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,最低检出量为102个拷贝数的质粒,特异性为100%,CT(Cycle Threshold)值的变异系数CV小于5%.对送检的15份(是否感染ASFV不确定)猪肉样品进行检测,结果全为阴性.试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析,从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法.

PMWS患病猪群中PCV2与CSFV、PPV、PRRSV混合感染的调查

应用套式PCR方法对采自辽宁、河北、河南、湖北、湖南、山东、浙江、福建和广西9个省份的733份临床发病猪肺脏和淋巴结样品进行了PCV2的检测,然后对鉴定为PCV2阳性的283份病料再分别进行PRRSV、PPV和CSFV的检测,以确定猪群中PCV2与CSFV、PRRSV和PPV双重感染情况,结果表明:CSFV、PRRSV和PPV阳性样品分别为74份、94份和46份,阳性率分别为26.1%、33.2%和16.3%。表明这些地区发病猪群中PCV2与这三种病毒的双重感染普遍存在,其中以PCV2和PRRSV的双重感染较为突出;但在河北和湖北两省,则以PCV2与CSFV的双重感染为主。

重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体ELISA的研究 Ⅰ.ELISA方法的初步建立及其标化

以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,对各种条件进行优化(如抗原的包被,作用时间及底物的选择),建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法。研究结果表明,重组抗原最适包被质量浓度为1mg/L,最适包被条件为4℃过夜,血清稀释度为1∶40,待检血清和酶标二抗的反应时间分别为37℃30min和40min,底物用TMB溶液,37℃显色10min。本研究对ELISA板的蛋白稳定剂、血清稀释液的显色系统和终止液进行了研究。用全病毒进行的阻断试验结果表明,全病毒能够阻断阳性血清与包被重组N蛋白抗原的结合反应。用此方法对几种繁殖障碍性疾病的阳性血清进行检测,均为阴性,无交叉反应,表明建立的ELISA具有很好的特异性。板内和板间重复性试验结果为,同1份血清板内各孔的变异系数和板间各次的变异系数均小于7%,表明本方法的重复性好。

应用气管环组织培养鉴定肾型传染性支气管炎病毒

气管环组织培养(TOC)是用于传染性支气管炎病毒(IBV)分离、鉴定和血清学检查的有效方法。Johnson(1975)应用 TOC中和试验将分离的 IBV 分为10个血清型;吕化广(1989)采用 TOC。

一步法多重RT—PCR检测新城疫、禽流感、传染性支气管炎病毒试验的研究

为了提高检测鸡肉中新城疫病毒 (Newcastlediseasevirus,NDV)、禽流感病毒 (Avianinfluenzavirus,AIV)、传染性支气管炎病毒 (Avianinfectiousbronchitisvirus,IBV)的效率和敏感性 ,利用引物设计软件PrimerPrimer5.0设计了NDV的F基因片段、AIV的M基因片段、IBV的M基因片段的引物。在以前一步法RT—PCR扩增各种病毒RNA的基础上 ,进行了两种病毒和三种病毒的一步法多重RT—PCR的试验。结果确定了两种病毒的一步法多重RT—PCR的试验条件 ,三种病毒的一步法多重RT—PCR的试验条件基本确立。本试验初步建立了检测NDV、AIV。

非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术,从含非洲猪瘟(ASFV)P72基因的克隆质粒BBBBPr4中扩增出1.94kb的P72基因。将P72基因和表达载体pET-30c(+)分别用限制性核酸内切酶FbaⅠ/XHoⅠ和BamHⅠ/XHoⅠ进行双酶切,然后在T4DNA连接酶作用下,将P72基因定向克隆至载体pET-30c(+)中相应位点上,并转化至宿主菌BL21(DE3)中,得到了重组菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)。经PCR鉴定,构建的重组菌株中含有P72基因。重组菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PAGE和Westernblot分析,结果表明衣壳蛋白P72基因可以在受体菌中高效表达,达到了菌体总蛋白的34%,表达产物的分子量约为78Ku,并能被ASFV抗体所识别。

己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备

以己烯雌酚 (DES)、琥珀酸酐和牛血清白蛋白 (BSA)等为主要原料 ,采用混合酸酐反应 ,首先合成己烯雌酚半琥珀酸酯 (DES- HS) ,经质谱分析鉴定后 ,再将 DES- HS结合到 BSA上 ,并用 SDS- PAGE对 DES- HS- BSA进行测定。以DES- HS- BSA免疫家兔 6次 ,用琼脂双扩散试验测定抗体。试验结果表明 ,高分辨质谱测得合成的 DES- HS分子量为36 8;BSA- HS- DES的 SDS- PAGE图谱经相关软件分析表明 ,单个 BSA上结合有 32个 DES- HS;琼脂扩散试验结果证实 ,免疫兔血清中含有抗 DES的抗体。本试验为下一步研制 DES残留免疫检测试剂盒及抗