miRNAs与哺乳动物生殖细胞发生

随着小RNA组学的兴起，越来越多不曾被关注的小RNA分子，如siRNAs，miRNAs，rasiRNAs和piRNAs等先后被发现。研究显示，相对于基因、蛋白质等具有复杂结构的生物大分子而言，这些结构非常简单的微型RNA对动物正常机能的维持、细胞增殖、分化、凋亡、器官形成、肿瘤形成等各种生命现象都具有极其重要的影响。

山羊重复手术收集胚胎防止粘连方法比较

山、绵羊重复超排和重复手术收集胚胎后生殖系统等易发生粘连,影响供体重复利用率和胚胎移植效率。本研究以波尔山羊作为供体,应用不同的防粘连方案进行供体重复超排采卵后预防粘连效果的比较,以筛选有效的预防粘连方法。采用32%右旋糖酐+肝素(试验组1)和医用几丁糖(试验组2)作为两个试验组,生理盐水冲洗法作为对照组。波尔山羊供体母羊连续超排4次,并重复手术采卵,用不同的防粘连剂进行术后处理比较。结果表明,试验组2使用几丁糖防粘连处理后,供体母羊第4次手术收集胚胎后粘连率只有37.5%,而试验组1和对照组粘连率为100%。使用防粘连剂对于供体母羊的超排效果及可用母羊的胚胎回收率无影响,但是显著提高了供体母羊的超排利用率。应用医用几丁糖防粘连的方法可以有效减少供体母羊的术后粘连率及有效提高供体母羊重复利用率。

Aroclor 1254对小鼠胚胎植入的影响

探讨了Aroclor 1254对小鼠胚胎植入的影响。将用无水乙醇溶解的Aroclor 1254母液分别按比例添加到CZB胚胎培养液中,组成0.25、1.25、6.25μg/mL 3个浓度的Aroclor 1254毒性试验溶液,溶剂对照组试验溶液为含无水乙醇(无水乙醇与毒性试验组浓度相同)的CZB胚胎培养液,空白对照组为CZB胚胎培养液。在小鼠配种后第4天上午(dpc 4.5),手术法分别暴露双侧子宫角,分别注入上述试验溶液5μL于子宫角内。于小鼠配种后第8天上午(dpc 8.5),尾静脉注射5 g/L台盼蓝溶液,检测试验小鼠胚胎植入位点。结果表明,溶剂对照组与空白对照组的平均植入位点没有统计学差异;质量浓度为0.25μg/mL和1.25μg/mL Aroclor 1254组的平均植入位点(6.27±1.41和5.83±1.09)与溶剂对照组(6.26±1.63)差异不显著;质量浓度为6.25μg/mL Aroclor 1254组的平均植入位点数(5.07±1.64)极显著低于溶剂对照组(6.26±1.63)(P<0.01),显著低于1.25μg/mL Aroclor 1254组(5.83±1.09)(P<0.05)。结果认为体内发育的胚胎,在接触到低剂量的Aroclor 1254时,会对胚胎植入产生一定的影响,随着接触剂量的增加,会显著降低胚胎植入数量,并表现出一定程度的剂量-毒性效应关系。

波尔山羊重复超排FSH用量的调整方法与效果

根据218只2～5岁经产波尔山羊的第1次超排反应及回收胚胎数将第2次超排母羊分为5个组(1组只有卵泡未排卵;2组母羊处理后未发情;3组黄体数≤4个;4组黄体数5～14个;5组黄体数≥15个),2次连续超排时间间隔60 d以上,采用递减法用FSH(Folltropin V)进行超排处理,第2次FSH给量根据第一次的超排效果进行调整。结果表明,1～5组的有效供体利用率分别为100%、75%、71.88%、93.10%和93.65%,5组有效供体比例差异不显著(P>0.05);1～5组的总胚胎数分别为14.00±5.73、12.10±6.78、11.77±7.26、13.84±7.04、18.03±9.06枚,5组的总胚胎数极显著高于其他4组(P<0.01);1～5组的回收可用胚胎数分别为12.81±6.04、10.33±8.12、10.08±7.14、11.34±6.58和15.37±7.64枚,5组超排后可用胚胎数显著高于2、3、4组(P<0.05),与1组间差异不显著(P>0.05)。根据供体首次超排效果调整波尔山羊重复超排FSH给量方案可行,首次超排无反应或超排反应差的个体,重复超排时增加FSH给量,可以使70%以上的个体成为有效供体。

巨噬细胞RAW264.7的培养及电转染条件的优化

为了建立最优的巨噬细胞RAW264.7培养方法和电转染条件,在细胞培养时采用两种方法了解细胞的培养特性并进行电转染条件的优化,建立并验证RAW264.7细胞快速、无血清培养体系的电转染方法。以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因,进一步优化巨噬细胞电穿孔的条件。通过控制电压（250~420 V）、脉冲时间、电击次数、温度、电击缓冲液等转染条件,采用不同的条件组合,用电穿孔法将质粒pEGFP-C1转染于培养的RAW 264.7细胞。通过荧光显微镜分析转染效率,可见：用胰酶和细胞刮刀消化RAW264.7细胞,细胞损伤小,形态好。利用优化的电转染条件得出最佳转染条件是：电压350 V、脉冲时间30 ms、电击1次、电击缓冲液成分为cell盐和options且V（cell盐）∶V（options）=3∶1、最佳温度4℃。

β-巯基乙醇和发情羊血清对牛颗粒细胞体外培养的影响

为满足实验室卵母细胞体外成熟共培养和胚胎共培养的需要以及进行卵巢颗粒细胞生物学功能等研究的需要,进行牛卵巢颗粒细胞的体外培养研究。在基础培养液TCM199中分别添加12.5、25、50、100、200μmol/L的β-巯基乙醇(BME),观察颗粒细胞生长状况;在基础培养液中分别添加体积分数为10%的发情山羊第1天血清、体积分数为10%的发情山羊第11天血清和体积分数为10%的胎牛血清,观察颗粒细胞生长和增殖情况。体外培养颗粒细胞的活细胞率随着添加BME浓度的增大而增加,在25μmol/L时达到最高,此后随浓度的增大而降低;发情山羊第1天的血清组中,颗粒细胞生长和增殖情况最好。BME可以提高颗粒细胞体外培养的活率,最佳添加浓度为25μmol/L;发情山羊第1天的血清可有效促进颗粒细胞体外培养生长和增殖。

牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及转染Ipr1基因

为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染。克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体。用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1转染至经体外纯化的第4～10代牛胎儿成纤维细胞,24h后观察荧光表达,48h后加入600μg.mL-1 G418,筛选1周,300μg.mL-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养。对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行PCR检测和核型分析。结果,转染24h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染PEG-FP-SRA-Ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经PCR检测在大约1 500bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体。说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性。可以作为核移植进行转基因克隆牛研究。

同源重组技术在转基因动物抗病育种中的应用

1抗病育种的概述转基因就是将目的基因导入受体细胞的过程。由于这一技术能够实现基因的种间转移,用于动物育种将大大提高育种的目的性而加快育种进程。

哺乳动物X染色体失活机制及其应用

1X染色体失活的起源及发展 哺乳动物X染色体失活是指雌性动物为了平衡与雄性动物X染色体基因表达量的差异，而失活其中1条X染色体的现象。X和Y染色体起源于1对同源的常染色体，自然选择的压力导致了1条染色体的某个基因突变，从而产生了决定性别的基因，进而产生了性别分化。