密闭培养条件下小鼠早期胚胎Igf2/H19印迹调控区甲基化状态分析

胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件.本文主要研究密闭培养条件对小鼠早期胚胎发育过程中印迹基因Igf2/H19的印迹调控区(ICR)甲基化水平的影响.应用亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析小鼠2-细胞胚胎在密闭条件下分别培养24h、48h和72h后,相对应的发育阶段胚胎Igf2/H19的ICR甲基化水平,以常规体外培养和体内发育的各阶段胚胎为对照.结果显示,密闭培养条件下,小鼠8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚的Igf2/H19的ICR甲基化水平都低于常规体外培养的结果,且更明显低于体内发育的结果;同时发现,小鼠8-细胞胚胎密闭培养时,Igf2/H19的ICR甲基化水平最低.由此可见,密闭培养会引起小鼠植入前各发育阶段胚胎Igf2/H19的ICR甲基化水平降低,并证明Igf2/H19的ICR甲基化水平可以作为监测哺乳动物早期胚胎发育状况的分子指标.

新生犊牛睾丸支持细胞的高效分离培养与鉴定

【目的】采用改良方法对犊牛睾丸支持细胞进行体外快速分离培养,以期建立一种简单快捷的支持细胞原代培养方法。【方法】采用1.0 g/L的Ⅳ型胶原酶和2.5 g/L的胰蛋白酶,对经分离曲细精管和组织剪碎2种方法处理的睾丸组织进行次第消化,比较2种方法对睾丸支持细胞分离效果的影响;采用福尔根染色法和免疫细胞化学方法鉴定睾丸支持细胞。【结果】睾丸组织采用分离曲细精管后进行酶消化的时间(8 min)较组织剪碎法(15min)短,并且前者消化所得有效细胞数(1.0×107)高于后者(0.81×107),两者具有显著差异(P<0.05);福尔根染色和免疫细胞化学染色结果显示,分离细胞有卫星核小体存在,且细胞中ABP阳性表达,表明分离培养的细胞确为睾丸支持细胞。【结论】睾丸组织经曲细精管分离后进行胶原酶和胰蛋白酶次第消化,有助于快速高效分离睾丸支持细胞。

ROS对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响

【目的】研究周期依赖性蛋白激酶抑制剂(Roscovitine,ROS)对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响。【方法】将山羊卵母细胞置于含不同浓度(0(对照),20,40,80,120,160,200μmol/L)ROS的成熟液中培养24h统计第一极体排出率,初步筛选山羊卵母细胞成熟培养液中添加ROS的有效浓度;将山羊卵母细胞在含不同浓度(0(对照),40,80,120,160,200μmol/L)ROS的抑制培养液中培养8或16h,再转入常规培养液中培养至24h,统计第一极体排出率,确定ROS适宜的浓度和作用时间。将卵母细胞放入添加40μmol/L ROS的培养液微滴中进行抑制培养,抑制培养8h后分别再常规培养0,2,4,6,8,10,12,14,16h,统计各处理第一极体排出率。将山羊卵母细胞在最佳ROS处理方案下抑制培养后进行孤雌激活,观察孤雌胚的发育情况。【结果】成熟培养液中加入40μmol/LROS抑制培养山羊卵母细胞8h后再转入常规培养液中培养至24h,是比较理想的ROS处理方案。山羊卵母细胞成熟培养的16h以前,全程抑制和抑制8h再常规培养2个试验组第一极体排出率与常规对照组无显著差异;分别培养18,20,22h时,2个试验组第一极体排出率均极显著低于对照组;24h时,抑制8h再常规培养组第一极体排出率(58.76%)与对照组(63.13%)接近,无显著差异。试验组成熟卵母细胞孤雌激活胚的囊胚率(46.75%)显著高于对照组(36.04%,P<0.05)。【结论】山羊COCs成熟培养液中加入40μmol/L ROS培养8h再转入常规培养液培养至24h,是山羊卵母细胞核质同步成熟较适宜的方案,此方案可以有效抑制18～22h核成熟卵母细胞的减数分裂恢复,推迟4～6h成熟,达到培养24h核质同步成熟的目的,提高了体外培养卵母细胞的质量。

奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及SRY基因性别鉴定

为了探索和建立奶山羊胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法,获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验用组织块培养法分离纯化得到两株奶山羊胎儿成纤维细胞系,进行细胞形态观察、生长曲线及细胞周期和倍性分析。同时根据GenBank上发布的山羊SRY基因设计合成一对PCR引物作为性别鉴定引物,另外根据山羊BLG基因序列设计一对引物作为内参引物,建立PCR反应体系对两株胎儿成纤维细胞系进行性别鉴定。结果表明,分离的胎儿成纤维细胞活力良好,可在体外快速生长、增殖、稳定培养;阳性对照和山羊胎儿成纤维细胞系2经PCR扩增得到337 bp片段和498 bp的BLG基因片段,而阴性对照和山羊胎儿成纤维细胞系1经PCR扩增得到498 bp的β-乳球蛋白基因片段。将337 bp片段和pMD19-T载体连接,构建重组载体pSRY,通过测序证明337 bp片段为SRY基因片段。这说明有337 bp扩增带的细胞系为雄性,无337 bp扩增带的细胞系为雌性。本试验为转基因奶山羊新品种的培育奠定了基础。

溶葡萄球菌素对小鼠肠道菌群结构的影响

【目的】研究溶葡萄球菌素对小鼠肠道菌群结构的影响,为溶葡萄球菌素的食用安全性评估提供参考。【方法】将24只7周龄ICR小鼠随机分为3个试验组和对照组,3个试验组分别提供溶葡萄球菌素含量为1μg/mL(低剂量)、5μg/mL(中剂量)和15μg/mL(高剂量)的饮水10mL/(只.d),于饮用第0(饮用前),1,3,7,14,21天以及停饮第3,7,14天采集小鼠新鲜粪便样品,采用PCR-DGGE技术检测小鼠肠道菌群结构变化。【结果】DGGE图谱显示,各组小鼠试验前后不同时间肠道内的优势菌种相似;经UPGMA聚类分析,与对照组相比,低、中剂量溶葡萄球菌素对小鼠肠道菌群结构影响较小,高剂量溶葡萄球菌素对小鼠肠道菌群结构影响较大;差异性分析结果显示,试验组饮用各阶段带谱与试验前的相似性与对照组相应阶段的相似性差异均不显著(P>0.05),溶葡萄球菌素低、中和高剂量组在停饮后第7天带谱与饮用前的相似性分别达到了70.8%,66.9%和63.8%;对图谱中主要条带进行测序和比对分析,结果表明,高剂量溶葡萄球菌素对小鼠肠道中Lactobacillus taiwanensis和1株不可培养细菌有促进作用。【结论】溶葡萄球菌素对小鼠肠道菌群结构的改变具有浓度依赖性,且停饮后小鼠肠道菌群结构有一定程度的恢复。

ω-3脂肪酸脱氢酶基因Fat-1的真核表达载体构建与表达

培养线虫(Caenorhabditis elegans),提取RNA并通过PT-PCR获得其ω-3脂肪酸脱氢酶基因Fat-1,整合入真核表达载体,构建了哺乳动物细胞表达载体pFat-IRES2-GFP,转染牛胎儿成纤维细胞系并对其进行G418筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染Fat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的HPLC分析结果表明,Fat-1基因已经整合入牛基因组中,并能够表达和发挥其ω-3脂肪酸脱氢酶的作用,促使-ω6PUFAs转变为相应的-ω3 PUFAs。ω-6脂肪酸总量从35.60%下降到25.47%,-ω3 PUFAs总量从5.75%上升到12.33%,多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.19下降到阳性细胞中的2.07,说明Fat-1基因整合是成功的,能够在细胞中以相应的-ω6 PUFAs为底物合成-ω3 PUFAs。

奶山羊BLG基因敲除载体的构建

根据已知的BLG序列设计引物,通过PCR技术克隆同源臂序列,5′端同源臂2 264bp,包括外显子1,3′端同源臂4 461bp,包括全部的外显子3、4、5、6、7,分别连入克隆载体pMD18-T Simple载体中并测序。然后以含有正负筛选标记基因的ploxpⅡ载体为基础,将5′端和3′端同源臂片段先后连入其中,进行酶切、PCR鉴定。将构建好的基因敲除载体转化组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌BM25.8,验证Loxp位点的活性。结果表明,构建了奶山羊BLG基因第2外显子缺失的基因敲除载体pBLG2T,且pBLG2T载体中的正选neo基因可以被Cre重组酶去除。为获得BLG 1条等位基因缺失型细胞株以及培育高产优质奶山羊新品种奠定基础。