兽医生物制品学教学改革与实践

兽医生物制品学课程是以预防兽医学和生物工程学为基础的综合性应用学科，主要研究动物疫病的免疫预防、诊断及治疗，达到增强动物机体特异性和非特异性免疫力，及时准确诊断动物疫病，并给予特异性治疗或无害化处理，防止疫病传播。该课程涉及生物制品的制造理论和技术、生产工艺、质量检验与控制、保藏、运输、使用方法等多学科多领域，且具有较强的实践性和应用性。

仔猪细菌源性腹泻的鉴别诊断及实验室检测方法

实际生产中,黄痢、红痢、白痢、黑痢、仔猪副伤寒和增生性肠炎因传播迅速、感染率高、病死率高,对仔猪健康造成严重危害,给养猪业带来重大经济损失,如何快速、准确地诊断和治疗该病成为兽医工作者的重要任务。但是,上述疫病病症相似,极易混淆,给临床诊断带来很大困难。

猪传染性免疫抑制性疾病及防控措施

猪传染性免疫抑制病损伤猪免疫系统,导致机体抵抗力下降,诱发、继发多种疾病,且多病共发下极难治疗,给养猪业带来巨大损失,如何科学、合理的认识、预防该病成为兽医工作者的工作重点之一。笔者根据临床经验和相关文献报道,综合多方面信息,系统阐述了猪传染性免疫治病的致病因素、发病机理、临床表现、危害、防控措施等五个方面,旨在对该病进行详细的介绍,以期对该病的治疗、防控提供理论依据。

仔猪球虫病的诊疗方法及综合防控措施

从流行病学特点、临床症状、剖检症状、诊断方法多方面详细介绍了仔猪球虫病的发病特点、诊疗方法和预防措施,旨在引起兽医工作者对该病的重视,同时也为猪场诊断、预防该病提供理论基础。

一例仔猪伪狂犬病的诊疗及防控措施

猪伪狂犬病可致仔猪呼吸道和神经症状,且仔猪日龄越小感染该病时症状越严重、治愈率越低、病死率越高,严重制约养猪业的发展。以前人研究为基础,笔者总结实际经验,以一例仔猪伪狂犬病为例,介绍伪猪狂犬病的临床症状、剖检症状、诊断方法、治疗和防治措施等,旨在为临床实践提供指导,同时也为猪场工作人员防治该病提供依据。

集约化猪场不同毒株猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗免疫后血液中持续带毒及抗体消长规律研究

某地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与中国高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(hp-PRRSV)同源性极高,为了筛选适合该地区病情的疫苗,指导养殖户生产,试验选择hp-PRRS弱毒活疫苗(JXA1-R株)和PRRS弱毒活疫苗(VR-2332株)作为疫苗候选株,选取30日龄、健康状况良好、群体差异性小的断奶仔猪30头,随机分成A、B和C组,每组10头,A组注射hp-PRRS弱毒活疫苗(JXA1-R株),B组注射PRRS弱毒活疫苗(VR-2332株),C组注射相同剂量生理盐水作对照,免疫前和免疫后14、28、42、56、70、84d采集血清,通过淋巴细胞计数、血清病毒核酸检测、血清抗体检测等分析猪体内hp-PRRS弱毒活疫苗(JXA1-R株)和PRRS弱毒活疫苗(VR-2332株)免疫应答情况。试验结果显示,淋巴细胞数量方面,仔猪免疫后,淋巴细胞数量均上升,42d时A、B组均达到最大值,A组为19.3×109/L,B组为16.7×109/L,C组则一直处于原始水平;抗体阳性方面,14d时A组为80%,B组为60%,C组为0,42d时A组为100%,B组为80%,C组为0;病毒核酸阳性率方面,14d时A组为90%,B组为100%,C组为0,42d时,A组为40%,B组为70%,C组为0,70d时,A组为0,B组为20%,C组为0。由此可知,hp-PRRS弱毒活疫苗(JXA1-R株)能快速诱导猪发生免疫应答、产生免疫抗体,抗体持续时间长、效价高、稳定性良好,且疫苗毒在体内存在时间短、减毒时间快、安全性高,对所研究地区猪群免疫具有优越效果。

禽戊型肝炎病毒组织切片免疫荧光检测方法的建立及应用

为建立对禽戊型肝炎病毒(HEV)鉴别诊断的组织切片免疫荧光方法,制备禽HEV ORF2蛋白的单因子血清,对感染HEV、禽白血病病毒(ALV)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)鸡的病变肝组织切片进行间接免疫荧光检测。结果显示制备的禽HEV ORF2蛋白的单因子血清具有良好的特异性,利用组织切片免疫荧光方法能够特异地检测禽HEV的感染,从而有效地区分HEV与易混淆的ALV、REV的感染。建立的鉴别诊断禽HEV的组织切片免疫荧光方法,可以有效地诊断禽HEV感染,给实验室诊断带来极大的方便。

2012年-2013年我国集约化猪场猪伪狂犬病病毒感染情况的调查

为研究全国范围内中大型猪场猪伪狂犬病病毒(PRV)感染情况,在2012年—2013年,应用PCR方法及gE-ELISA试剂盒对采集自17个省126个集团或猪场的164份病料、2 212份血清进行猪伪狂犬病(PR)病原及血清野毒gE抗体的检测。结果表明,病料样品中,PRV野毒阳性率为34.1%,PRV野毒阳性猪场占检测猪场总数的38.6%;血清样品中,PRV野毒抗体阳性猪场48个,猪场阳性率为38.1%,总样品阳性率为14.96%;2013年的感染率比2012年的高,且冬、夏两季PRV野毒阳性率较高;保育猪的PRV野毒阳性率最高,为22.34%,种母猪群PRV野毒阳性率为14.32%;华东地区PRV阳性比例最高,南方地区的PRV野毒阳性率高于北方地区。通过本次调查,说明PRV在我国的猪场依然普遍存在,对猪场进行PR的控制和净化是非常必要的。

广州地区犬细小病毒VP2基因的序列分析

犬细小病毒病是一种高度接触性传染病,临床上以急性出血性肠炎和心肌炎为特征。为研究广州地区犬细小病毒病的流行亚型,本试验采集2011—2012年间疑似病犬粪便,进行犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)分离鉴定,提取病毒基因组进行VP2基因扩增和序列分析,与GenBank中登录的参考毒株进行比对,结果发现,分离的8株CPV中SCAU-5为CPV-2b亚型,其余为CPV-2a亚型。结果表明,2011—2012年间广州地区的流行毒株以CPV-2a亚型为主。

一株产角蛋白酶的铜绿假单胞菌的分离鉴定

本研究从鸡场长期堆放羽毛的土壤中筛选到一株降解羽毛能力强的菌株。该菌株在牛奶平板上培养24h后产生透明降解圈,形状不规则,表面粗糙,边缘模糊,产生绿色荧光色素;革兰氏染色阴性,短杆状,无芽孢,有鞭毛,无荚膜。生化试验显示,该分离株能够水解牛奶、明胶,具有角蛋白酶活性,能利用柠檬酸盐,硝酸还原反应阳性。系统进化树分析显示,分离株与铜绿假单胞菌模式菌株(GenBank登录号:BAMA01000316)亲缘关系最近,综合以上结果,最终确定分离株为铜绿假单胞菌,并正式命名为Pesudomonas aeruginosa B1-2。将该分离株在以1%羽毛为唯一碳氮源的基础培养基中发酵培养,48h后角蛋白酶活性最高达到60.3U/mL,对羽毛降解率为85.7%。本研究中分离获得的Pesudomonas aeruginosa B1-2可用于畜禽废弃物的处理。

2012年～2014年我国东南地区HP-PRRSV GP5基因的遗传进化与变异分析

为分析高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的遗传变异情况,本研究对2012年～2014年东南地区8个省市21份HP-PRRSV阳性样品的GP5基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,并将其进行序列比对和遗传进化分析.结果表明：本研究检测的21株HP-PRRSV GP5基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为81.1％～99.8％和75.1％～100％.其中有13个病毒株的GP5基因与JXA1株同属于2.2亚群,其余8个病毒株的GP5基因与台湾2007年、2013年分离株属于2.3亚群.遗传进化树分析表明,2.3亚群是2014年流行的一个新兴亚群,它的流行可能与两地猪群贸易交流频繁有关,其GP5基因在抗原表位和糖基化位点发生了一定的变异.本研究结果为HP-PRRSV遗传进化分析和疫病防制提供了新的参考.

2011-2014年山东省H9亚型禽流感病毒HA基因遗传变异分析

对2011-2014年山东26个H9亚型AIV毒株的HA基因进行测序分析。结果显示,所有毒株均属于h9.4.2.5亚分支,与疫苗株GD/SS/94、SD/6/96、SH/F/98的核苷酸相似性为88.0%-91.5%。HA裂解位点均只有一个碱性氨基酸（R）,符合低致病性AIV的特征。所有毒株在234位发生了谷氨酸Q→亮氨酸L的突变,呈现出典型的人流感病毒受体结合特性。所有毒株在313-315位均新增1个潜在糖基化位点,且部分毒株在145-147位出现新潜在糖基化位点NGT。结果表明,山东省H9亚型AIV基因已发生较大变异,因此需要加强禽类生产贸易的监测和生物安全措施,及时更新疫苗毒株,控制H9亚型AIV的传播。

独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体的构建

为了构建能同时独立表达双基因的重组伪狂犬病毒通用转移载体,试验采用前期构建的p UC19-g E/HEK为骨架,将设计合成的独立表达双基因的表达盒(p CMV+MCS1+p CMV+MCS2+BGH p A)克隆至其XbaⅠ位点,获得通用转移载体pg E-CMV2,以多克隆位点限制性内切酶单酶切,并将EGFP基因克隆至MCS1的SpeⅠ/PstⅠ位点、DsRed基因克隆至MCS2的KpnⅠ/XhoⅠ位点,转化BHK-21细胞同时观察荧光。结果表明:多克隆位点限制性内切酶单酶切pg E-CMV2呈现单一条带,EGFP和DsRed均呈现目标荧光,且将两种荧光蛋白分别克隆至同一分子的MCS1与MCS2,两种荧光蛋白均能有效表达。说明pg E-CMV2构建正确,且能独立有效表达双基因,可用于实现将两个或多个外源基因一次重组入PRV基因组中,实现"一针多防"。

DNA疫苗研究进展

利用生物技术手段开发新型基因工程疫苗是目前疫苗研究的热点之一。本文介绍了DNA疫苗的简史、优缺点、安全性、优化方法等,旨在为广大科研工作者提供参考。

Ⅰ群4型禽腺病毒感染鸡阳性血清的制备及其在IFA中的应用

用LMH细胞扩繁I群禽腺病毒血清4型(FAd V-4)并通过口服途径感染24周龄SPF公鸡,心脏无菌采血制备鸡抗FAdV-4血清。通过ELISA、AGP、IFA和HI等方法检测血清,结果未见其他禽类常见病毒抗体。该血清用于间接免疫荧光检测FAd V-4,染色效果较好,测定FAID50敏感性高。试验结果表明,该批血清2000倍稀释可以作为一抗用于FAd V-4毒价检测。

全悬浮MDCK细胞驯化与H9亚型禽流感疫苗毒种制备

为了研制悬浮细胞源H9亚型禽流感灭活疫苗,笔者对细胞和疫苗毒种进行了驯化。将贴壁的MDCK细胞利用直接适应无血清法经过方瓶预驯化3代、摇瓶培养驯化13代得到了一株适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系,命名为MDCK(DHN)细胞系。该细胞密度高,呈单个分散生长,形态饱满,大小均一,活性强。在此基础上,将H9亚型禽流感CN株鸡胚毒通过悬浮MDCK(DHN)细胞连续传代驯化9代后得到了在细胞中稳定、高效复制的CN株细胞毒,并且该CN株细胞毒与CN株鸡胚毒在抗原性和免疫原性等生物学特性均保持了一致。本研究成功研制了可用于悬浮细胞源H9亚型禽流感灭活疫苗生产的MDCK(DHN)悬浮细胞系和细胞毒种。

猪细小病毒病的诊断及防治措施

从临床症状、病理变化、诊断方法等多方面详细介绍了猪细小病毒病的发病特点、诊断和预防措施,旨在引起兽医工作者对该病的重视,同时也为猪场诊断、预防该病提供理论基础。

自动尿囊液收获机胚液收集吸头的改进及其在禽流感疫苗半成品生产上的初步应用

对自动尿囊液收获机的收集吸头进行了改进,对改进效果进行了禽流感疫苗生产的实验室验证和生产车间使用验证。结果表明,改进后的收集吸头可在保证收获效率的同时,有效地避免套管内过高负压导致的卵黄囊破裂现象,降低了卵黄污染,提高了胚液澄清度,增加了胚液利用率。

禽流感油乳剂灭活疫苗抗原质量快速评价方法

本研究建立了基于肉豆蔻酸异丙酯作为破乳剂的一种禽流感油乳剂疫苗抗原快速检测方法,该方法成本低且环境友好,实验条件简易,保真度高,可在数小时内准确快速测定禽流感等油乳剂疫苗成品抗原HA效价及分析其抗原性差异。使用该方法能够方便广大养殖用户从不同来源疫苗中有针对性地选择优质高效的疫苗,并在使用疫苗前确定其抗原效价,避免使用低效价疫苗,确保预期防控效果,同时也方便兽药监察部门对市场上各个厂家的禽流感油乳剂灭活疫苗的质量进行实时监测。

整合REV LTR序列的MDV弱毒株的分离鉴定与生物学特性

【目的】从非免疫健康三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV),命名为MDV GD06株,本工作系统研究了其生物学特性。【方法】PCR扩增GD06株Meq基因及短末端重复区(RS)序列,进行序列分析,并用间接免疫荧光试验进行血清型特异性鉴定;通过接种SPF鸡和鸡胚成纤维细胞(CEF)来判定GD06株体内外的增殖能力;为确定GD06株的致病性,用1日龄SPF鸡进行攻毒试验。【结果】GD06株为MDV血清I型病毒,其基因组中自然整合禽网状内皮增殖症病毒(REV)的长末端重复序列(LTR),Meq基因富含脯氨酸的结构域比参考强毒株Md5多59个氨基酸,与MD商品化疫苗CVI988/Rispens和814株相符,具有弱毒株的特征。在接种CEF细胞96、120、144、168、192 h,GD06株病毒滴度分别为1.9×105、3.9×105、6.1×105、6.5×105、5.8×105PFU,明显比CVI988/Rispens(病毒滴度分别为1.3×105、3.5×105、5.0×105、5.7×105、4.7×105PFU)高(P<0.05);接种SPF鸡21、28天,GD06株在鸡体内的病毒滴度分别为740和350 PFU,明显比CVI988/Rispens株(病毒滴度分别为460、216 PFU)高(P<0.05),结果表明,GD06株在CEF细胞和鸡体内具有比CVI988/Rispens更快的增殖能力。人工接种攻毒实验表明,GD06株对SPF鸡没有致病性,不引免疫抑制。【结论】研究结果表明,MDV GD06株为国内首次分离的自然整合有REV LTR序列的重组MDV弱毒株。