《园艺植物生物技术》课程建设研究与实践

《园艺植物生物技术》是园艺专业本科教学核心课程之一。文章阐述了《园艺植物生物技术》课程建设背景、建设思路与基本措施。从提高认识、加强教学队伍、精选教学内容、推进双语教学、在线开放课程建设以及优化教学方案与模式等方面,进行高质量课程建设,注重学生基础理论与基本技能学习,努力将学生引向园艺植物生物技术学科发展前沿,促进了高素质、国际化的园艺创新型人才培养。

胡萝卜中DcDofD1转录因子的克隆及其对非生物逆境胁迫的响应分析

Dof(DNA-binding with one finger)转录因子是植物特有的一类转录因子,该类转录因子在植物生长发育过程中起重要作用。本试验以胡萝卜黑田五寸和君川红为试验材料,分别从中克隆获得Dc Dof D1转录因子基因。采用生物信息学方法对Dc Dof D1转录因子氨基酸组成、理化性质、进化关系进行了分析。并利用实时定量PCR方法对Dc Dof D1基因在非生物胁迫下的表达量进行了分析。结果表明,黑田五寸和君川红中的Dc Dof D1转录因子具有明显的单锌指结构,保守域的氨基酸序列比较保守。进化分析显示,Dc Dof D1属于Dof家族的D1亚族。在胡萝卜黑田五寸和君川红中,Dc Dof D1基因对高温、低温、干旱、盐等非生物胁迫有响应。而不同胡萝卜材料中,Dc Dof D1基因对非生物逆境响应的强度和速度不同。

白菜类作物开花时间相关基因BraA.FLM.a的CAPS标记开发与利用

[目的]本文旨在研究白菜类作物开花时间候选基因BraA.FLM.a的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记开发与利用。[方法]PCR扩增2个亲本的BraA.FLM.a基因外显子2到内含子2区域的特异序列,开发CAPS标记BraA.FLM.a-NlaⅢ,用CAPS标记对F2分离群体的基因型进行检测,并进行Pearson相关性分析研究基因型与开花时间表现型的关系。[结果]通过调查亲本早开花油用型品种‘Yellow sarson’材料YS-143和晚开花芜菁品种‘Vegetable turnip’材料VT-044的开花时间和F2群体的开花时间,发现两亲本的开花时间存在显著性差异。通过PCR扩增克隆了两亲本的BraA.FLM.a基因的特异序列,并在突变位点T-A处开发出CAPS标记BraA.FLM.a-NlaⅢ。在136份F_2分离群体上进行此CAPS标记的验证后,发现T基因型开花时间晚于A基因型的开花时间,并且差异显著(P<0.05)。[结论]BraA.FLM.a基因的CAPS标记BraA.FLM.a-NlaⅢ与开花时间表型显著相关,该标记可以用作开花时间的分子选择辅助育种。

白菜类作物开花时间相关基因CCA1的克隆及功能标记开发

以1年生的油用型品种Yellow sarson(YS-143)与2年生的芜菁品种Vegetable turnip(VT-044)的cDNA为模板,克隆出CCA1基因cDNA全长序列,分析其核苷酸多态性。在这2份材料构建的200株F2分离群体中,选取极早和极晚开花的单株各24株,对在亲本上鉴定到的4个多态性位点进行PCR扩增,采用Pearson相关性分析研究基因型与开花时间表现型的关系。构建pEZS-NL-CCA1载体,利用亚细胞定位技术,分析CCA1基因在真核细胞中的表达情况。序列分析表明,YS-143与VT-044分别有1 665、1 647个核苷酸,分别编码了554、548个氨基酸。亲本之间核苷酸序列分析鉴定到12个差异位点,氨基酸同源进化树分析表明,十字花科的不结球白菜、大白菜、萝卜、油菜、拟南芥、亚麻芥聚集在同一分支中,而禾本科的大麦、玉米、水稻聚集在另一分支中。在F2分离群体上,Pearson相关性鉴定到位于亲本第727至第732个碱基处的1个多态性位点(ACCCTT/ACCCTT),有该位点的群体单株平均开花时间为39 d,极显著早于缺失该位点的群体单株平均开花时间104 d(P<0.01),表明白菜类作物CCA1基因的第727至第732个碱基的缺失(A05:472204-472209)与开花时间呈极显著相关,影响开花时间,可为光周期敏感的白菜类作物晚抽薹育种研究提供一定的理论依据。开发的该Insert/Delete(InDel)标记,可以作为功能分子标记进行辅助育种工作,以加快育种进程。亚细胞定位结果表明,CCA1基因主要在细胞核上表达。

芹菜过敏原蛋白Api g 1基因的克隆与表达分析

以2个芹菜(Apium graveolens)品种‘津南实芹’和‘美国西芹’为试验材料,分别克隆出过敏原蛋白Api g 1基因。序列分析表明,‘津南实芹’和‘美国西芹’中的过敏原蛋白基因Api g 1均含有1个480 bp的开放阅读框及1个148 bp的内含子,分别编码159个氨基酸,二者有2个核苷酸位点的差异,编码的氨基酸有1个位点差异。‘津南实芹’和‘美国西芹’的过敏原蛋白Api g 1与胡萝卜、欧芹等植物的过敏原蛋白相似度较高,在保守区域有7个甘氨酸残基,空间结构上由3个螺旋和7个折叠组成。实时定量PCR表达分析显示,该基因在主根中表达较高,茎其次,其他部位表达较弱,具有明显的组织特异性。

耐裂果与易裂果番茄果实发育过程中果实组织衰老与裂果的关系

[目的]通过研究耐裂果与易裂果番茄果实成熟过程中不同部位组织的衰老状况,揭示番茄果实组织衰老与裂果的关系,为裂果的防控提供理论依据。[方法]采用耐裂果番茄材料LA1698与易裂果番茄材料LA2683,测定其果实不同时期(绿熟期、转色期和红熟期)和不同部位(上部、中部和下部)的活性氧含量、膜脂过氧化程度、抗氧化酶活性、抗氧化物质As A及可溶性蛋白含量。[结果]与果实中部和下部相比,番茄上部具有更高的活性氧含量和膜脂过氧化程度;在果实成熟后期,相同部位相比,易裂果番茄的活性氧含量和膜脂过氧化程度高于耐裂果番茄。易裂果番茄红熟期果实相同部位抗氧化酶SOD、GR和APX活性及抗氧化物质As A含量显著低于耐裂果番茄。[结论]随着果实的成熟,无论易裂果番茄还是耐裂果番茄均逐渐衰老,果实不同部位的组织衰老程度不同,果实上部衰老最快,同时也是裂果最易发生的部位。易裂果番茄上部活性氧代谢失调,膜质过氧化程度高,进而引起果实的衰老加速,这可能是导致裂果从上部开始发生的原因之一。

不结球白菜抗坏血酸合成基因BcGME的同源克隆及胁迫下的表达分析

[目的]本文旨在探究逆境下BcGME基因与抗坏血酸(As A)含量的关系,为培育高品质的不结球白菜品种奠定理论基础。[方法]以不结球白菜‘苏州青’为材料,同源克隆了BcGME基因的全长,应用生物信息学分析了其氨基酸序列,通过实时荧光定量PCR技术测定了BcGME基因在过氧化氢胁迫和水淹胁迫下的表达水平,利用高效液相色谱(HPLC)测定了相应的抗坏血酸含量。[结果]BcGME基因包含一个长度为1 137 bp的开放式阅读框(ORF),编码379个氨基酸。推测其蛋白理论相对分子质量为42.97×103,理论等电点p I值为5.84,分子式为C1907H2949N519O570S22,属于不稳定蛋白。总平均疏水指数为-0.440,属于亲水蛋白。亚细胞定位预测该蛋白分布在细胞质中。BcGME氨基酸序列与十字花科大部分植物的相似性为90%以上,不结球白菜BcGME与十字花科的大白菜、甘蓝型油菜、拟南芥相应蛋白的进化距离较近。过氧化氢胁迫下,As A含量在6 h达到峰值,同时BcGME基因的表达量也达到最高;水淹胁迫下,1 d时As A含量最高为12.99μg·g^(-1),随后As A含量急速下降,1 d时的BcGME基因表达量是0 d的1.5倍。[结论]过氧化氢胁迫和水淹胁迫下,不结球白菜植株中BcGME基因的表达量变化趋势与As A含量变化趋势一致,说明GME可能是不结球白菜抗坏血酸合成途径中的关键调控基因。

野生瓣化型雄性不育胡萝卜‘武野-不育’的特征鉴定与分析

胡萝卜雄性不育材料,在胡萝卜育种中具有重要作用。本研究描述了一种从武汉市洪山区野生胡萝卜材料中获得的野生瓣化型胡萝卜雄性不育材料(‘武野-不育’,简称‘Wuye-BY’)的特征。该野生瓣化型雄性不育胡萝卜特征在于:无明显膨大的肉质根,嫩茎、叶片及其叶柄深绿色,几乎无毛,无花瓣和花药。花萼数量8~10个,花丝数量为0~2个,染色体数目为2n=18。双悬果顶端及其花丝顶端具有大量的蜜液,能接受栽培胡萝卜花粉。杂交F1的根大小、根重,胡萝卜素、总糖和维生素C含量,具有明显优势。

芹菜NHL-like蛋白基因克隆与表达分析

植物生长发育过程中会遭遇各种病原物的攻击,植物为了应对这些危害并适应外界的生存竞争,逐渐演化出了复杂的防御机制。NHL基因家族庞大,部分NHL基因受病原物诱导后会过量表达,增强植物对多种病原菌的抗性,是与植物防御机制密切相关的蛋白。本研究以津南实芹和美国西芹2个芹菜品种为试验材料,分别克隆出NHL-like蛋白基因AgNHL。序列分析表明,上述2种芹菜的AgNHL基因序列均含636 bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。2种芹菜碱基序列,只有第36位不同,津南实芹为T,美国西芹为C,2种碱基序列相似性高达99.84%,编码的氨基酸序列相同。进化分析显示,2种芹菜的NHL-like蛋白与葡萄、大豆等植物的相似度较高,在第80～185氨基酸间含一个LEA-2蛋白保守结构域。荧光定量PCR结果表明,AgNHL基因主要在芹菜茎中表达,根中表达量最低,有明显组织特异性,品种差异也很显著。对2种芹菜分别进行4℃低温、38℃高温、20%PEG处理、0.2 mol/L NaCl处理2 h表达分析显示,低温、盐处理下该基因表达量明显上升。

大蒜气生鳞茎形态发生及其碳水化合物和内源激素含量以及相关基因表达的变化特征

以大蒜品种‘二水早’(早熟)、‘麻江红蒜’(中晚熟)和‘徐州白’(晚熟)为材料,采用石蜡切片技术结合显微观察探讨气生鳞茎形成过程中植株茎尖和花序轴形态变化,并测定了‘麻江红蒜’气生鳞茎形成过程中可溶性糖、蔗糖、淀粉和内源激素含量及相关基因表达变化,明确不同熟期各品种大蒜气生鳞茎形成进程和形态解剖学特征,以及碳水化合物和内源激素与大蒜气生鳞茎形成的关系,以探讨大蒜气生鳞茎分化的生理机制。结果表明:(1)依据茎尖生长点和花序轴的形态解剖特征,将气生鳞茎形成进程划分为启动期、气生鳞茎原基分化期(包括保护叶原基、贮藏叶原基分化)、气生鳞茎膨大期和气生鳞茎成熟期等4个时期;3个品种气生鳞茎在相同发育时期的形态解剖学特征相同,但分化时间不同,其分化顺序与大蒜品种成熟期表现一致;当总苞叶叶尖露出叶鞘,花器官原基分化时,花序轴周围分生组织区域产生小突起,标志着气生鳞茎原基分化的开始;外层保护叶由白色转为紫色时气生鳞茎进入成熟期。(2)气生鳞茎开始膨大后,其可溶性糖和蔗糖含量均显著降低,淀粉含量显著升高;ZR含量在启动期显著升高;IAA和MeJA含量在气生鳞茎原基分化期维持在较高水平,但IAA含量随着气生鳞茎膨大显著降低,并在成熟期降至最低。(3)果聚糖代谢相关基因1-SST、1-FEH分别在膨大初期、膨大中期表达量显著升高;细胞壁转移酶基因CWI相对表达量在气生鳞茎原基分化期显著升高;蔗糖信号转导基因T6P和生长素信号转导的关键转录因子ARF1相对表达量均在气生鳞茎分化期显著升高;茉莉酸信号调控途径中的负调控因子JAZ相对表达量在大蒜气生鳞茎原基分化期和膨大初期均维持一个较低水平。研究认为,大量可溶性糖及ZR在茎尖积累,可以启动气生鳞茎原基分化,促进气生鳞茎形态发生;高浓度IAA和MeJA可促进气生鳞茎原基分化;气生鳞茎膨大消耗可溶性糖,且低浓度IAA有利于气生鳞茎膨大;成熟的气生鳞茎积累大量淀粉。

不结球白菜乙烯响应因子基因的克隆与表达分析

采用cDNA-AFLP技术,以不结球白菜雄蕊突变系‘苏白2号’及其保持系花蕾为实验材料,分离出1条编码乙烯响应转录因子的基因,命名为NhccERF1。结果显示:(1)序列分析表明,NhccERF1基因长807bp,编码268个氨基酸。(2)RT-PCR分析发现,花期NhccERF1基因在花瓣、雄蕊及花柱中表达量均显著高于保持系。(3)实时定量荧光PCR(qPCR)发现,蕾期喷施乙烯(ET)能促进NhccERF1基因的表达,外施AgNO3抑制该基因表达。研究推测NhccERF1基因可能在雄蕊变异中发挥重要作用。

不结球白菜过氧化还原蛋白基因Brc2-Cys Prx的克隆和表达分析

[目的]双半胱氨酸型硫氧还蛋白过氧化物酶Brc2-Cys Prx是过氧化还原蛋白Peroxiredoxins(Prxs)的亚家族。Prxs是植物抗氧化酶防御系统的成员,对清除植物体内活性氧具有重要作用。本文旨在克隆和研究Brc2-Cys Prx基因在不结球白菜处于不同胁迫条件下的表达模式。[方法]以不结球白菜霜霉病抗病自交系‘苏州青’和霜霉病感病自交系‘矮脚黄’为试验材料,利用RACE技术克隆得到不结球白菜Brc2-Cys Prx基因。利用生物信息学方法对该基因进行信息学分析。采用qRT-PCR技术对不结球白菜叶片Brc2-Cys Prx基因在霜霉病菌侵染及NaCl、CdCl_2、PEG6000和ABA等非生物胁迫处理条件下的表达模式进行研究。[结果]Brc2-Cys Prx基因的c DNA全长为999 bp,其中开放阅读框长度为810 bp,共编码270个氨基酸。该蛋白不存在信号肽序列,预测相对分子质量为28.15×10~3,理论等电点为5.87。不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。该蛋白含有1个PRX_Typ2cys结构域,属于硫氧还蛋白超家族。系统进化分析表明:不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜和甘蓝型油菜进化关系最近。霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx基因表达呈逐渐上调趋势,在‘矮脚黄’中的表达与‘苏州青’相比上调迟钝,且该基因在‘矮脚黄’中的表达量一直低于‘苏州青’。0.2 mol·L^(-1)NaCl和200 g·L^(-1)PEG6000处理抑制Brc2-Cys Prx基因的表达;150μmol·L^(-1)CdCl_2处理促进Brc2-Cys Prx基因的表达,在24 h达到最大值;100μmol·L^(-1)ABA处理后,Brc2-Cys Prx基因表达上调,而12 h后,表达受抑制。[结论]霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx在抗性系‘苏州青’和感病系‘矮脚黄’中的表达存在差异,并且在抗病系中的表达量较高,推测Brc2-Cys Prx基因的高转录水平是抗病品种较之感病品种对霜霉病菌侵染具有更高抗性的原因之一。在非生物胁迫条件下,Brc2-Cys Prx基因具有不同的应答模式,推测可能是涉及到不同的物质或信号途径的原因。

大蒜花芽分化进程及其解剖结构和形态特征变化

为明确大蒜(Allium sativum Linn.)的花芽分化进程,以不同特性的品种‘二水早’(‘Ershuizao’)、‘太仓白’(‘Taicangbai’)、‘徐州白’(‘Xuzhoubai’)和‘美国大蒜’(‘American garlic’)为材料,采用石蜡切片技术对分化过程中花芽纵切面的解剖结构进行了研究,并观察了花芽形态特征变化,据此对花芽分化期进行划分,并比较了不同品种间花芽分化时间的差异。结果表明:依据花芽解剖结构的差异和形态特征变化,可将大蒜花芽分化过程划分为未分化期、总苞和花序原基分化期、小花原基分化期(包括小花原基、苞片和珠蒜原基分化)以及花器官原基分化期(包括花被片、雄蕊和雌蕊原基分化)4个时期,后3个时期共同构成花序形成期;在总苞和花序原基分化期,茎尖生长点形态开始改变,可作为大蒜花芽开始分化的指征。品种‘二水早’、‘太仓白’和‘徐州白’花芽分化各时期的解剖结构与形态特征基本一致,而品种‘美国大蒜’在小花原基分化期不分化苞片和珠蒜,故其小花原基分化期的解剖结构和形态特征与另3个品种略有不同。根据苞片和珠蒜的有无,可将供试4个品种的花序分为2类:一类花序中包含异常小花以及珠蒜和苞片,小花随珠蒜膨大而枯萎退化,导致无法正常开花,具有该类花序的为‘二水早’、‘太仓白’和‘徐州白’3个不开花品种;另一类花序中有小花但无珠蒜,小花可正常开花,具有该类花序的为开花品种‘美国大蒜’。田间自然条件下,品种‘二水早’花芽分化最早,而品种‘徐州白’花芽分化最晚;品种‘二水早’花芽分化持续时间最短(仅53 d),另3个品种的花芽分化持续时间在60 d以上;在花芽分化期间,以总苞和花序原基分化期历时最短(9～11 d),花器官原基分化期历时最长(31～37 d),表明不同大蒜品种花芽分化开始日期和分化持续时间存在差异,早熟品种花芽分化早于晚熟品种。

小菘菜游离小孢子培养和植株再生

以7个基因型的小菘菜品种为供试材料,采用游离小孢子培养技术,研究基因型、培养方法、激素及AgNO3对小孢子胚芽诱导率和植株再生的影响。结果表明:基因型是影响小菘菜小孢子胚芽诱导率的最重要的因子;小菘菜小孢子培养初期用170 g.L-1蔗糖处理1 d后,更换培养基能显著提高小孢子的胚芽诱导率;0.05 mg.L-16-BA和0.2 mg.L-1NAA能促进小菘菜小孢子胚的发生;添加0.1 mg.L-1GA3和0.3或0.4 mg.L-1AgNO3可显著提高小菘菜小孢子胚的胚芽诱导率和平均每胚出芽数。

不结球白菜响应ABA和低温基因WRKY18的克隆及表达分析

[目的]WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物的生长发育、生物及非生物胁迫响应。克隆和鉴定不结球白菜共同响应ABA和低温的WRKY基因,对研究不结球白菜抗逆分子机制和改良其抗逆性具有重要意义。[方法]采用电子克隆的方法在NCBI数据库中进行不结球白菜WRKY18基因全长拼接,然后在不结球白菜‘苏州青’中,克隆到1个与低温及ABA响应相关的WRKY基因,通过生物信息学手段和实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析了该基因的序列结构特征及其在低温和ABA处理下的表达变化。[结果]该基因全长为1080bp,含有978bp的开放阅读框,编码326个氨基酸,与油菜及拟南芥的WRKY18直系同源,氨基酸序列相似性分别为87%和73%,命名为BcWRKY18。序列分析表明,该编码蛋白为核蛋白,不含跨膜区,无信号钛,具有WRKYGQK基序(motif)约60个氨基酸残基的WRKY保守结构域,为WRKY转录因子家族成员。系统聚类分析指出了BcWRKY18蛋白的保守性及其在开花植物中的进化关系;序列结构和同源建模分析指出了BcWRKY18蛋白的保守结构域、蛋白质的二级及三级结构分布模型;qRT-PCR检测了BcWRKY18基因在ABA和低温胁迫下的表达,表明低温和ABA都能诱导BcWRKY18基因表达,其表达模式都存在相似的过程,且BcWRKY18基因对ABA的响应比对低温的响应更快、更明显。[结论]从不结球白菜中克隆获得1个新的WRKY类转录因子基因BcWRKY18,基因表达分析发现BcWRKY18可能存在对ABA和低温的共响应及自身反馈调控。

水分胁迫对紫色不结球白菜花色苷合成及相关基因表达的影响

用250g·L-1的聚乙二醇(PEG 6000)溶液模拟水分胁迫处理‘紫冠1号’紫色不结球白菜,运用液质联用和荧光定量PCR方法,分析水分胁迫下其叶片中花色苷质量分数、成分的变化以及花色苷合成基因BcPAL、BcCHS、BcCHI、BcF3H、BcDFR、BcANS和BcUFGT的表达特性。结果显示:1水分胁迫诱导不结球白菜积累花色苷;2共检测到11种主要的花色苷组分,分为矢车菊素类花色苷和飞燕草素类花色苷2大类,水分胁迫对不同花色苷质量分数的影响作用不同;3水分胁迫条件下,BcPAL、BcCHS和BcDFR基因的表达先升后降,BcF3H和BcUFGT基因在水分胁迫下被持续诱导表达,BcANS和BcCHI基因的表达量在胁迫初期有所下降,随后又逐渐升高。

不结球白菜游离小孢子培养及植株再生研究

为进一步优化不结球白菜游离小孢子培养技术体系,本研究以20个不同基因型的不结球白菜为试验材料,研究不同基因型、4℃低温胁迫处理时间和头孢噻胯浓度对游离小孢子胚胎发生的影响,并对小孢子胚胎发育和再生过程进行观察和倍性鉴定。结果表明,当花瓣/花药(P/A)长度比值为0.85～1.10时,不结球白菜小孢子主要处于单核晚期;共有10个基因型不结球白菜出胚,其中出胚率最大的为H20,平均出胚率为7.75胚·10蕾^(-1);4℃低温胁迫处理1 d时不结球白菜出胚率最高;头孢噻胯对不结球白菜出胚率的影响与基因型密切相关;从胚状体到再生幼苗阶段,不结球白菜基因型不同,其胚胎再生频率也不同;倍性鉴定共检测出21个双单倍体和2个单倍体,自然加倍率为91.3%,不结球白菜植株形态表现出明显的多样性。本研究结果为不结球白菜游离小孢子高效培养体系的优化提供了一定的技术支撑。

不结球白菜雄蕊瓣化相关AP3基因的克隆和表达分析

[目的]APETALA3(AP3)转录因子是特异性作用于花瓣和雄蕊的MIKCc-型植物MADS转录因子。通过分离和检测不结球白菜雄蕊变异系的Bc AP3基因,探究不结球白菜稳定雄性不育系的机制。[方法]利用同源克隆基因的方法,以不结球白菜突变系和保持系的早期花蕾总RNA为研究对象,克隆出2个AP3同源基因Bc AP3-1和Bc AP3-2,然后利用生物信息学方法对这2个基因的核苷酸和蛋白氨基酸序列结构和组成进行信息学分析。采用半定量PCR技术,对不结球白菜中2个AP3家族基因在不同发育时期及不同组织部位的表达进行了研究。[结果]Bc AP3-1基因的c DNA全长为698 bp,编码231个氨基酸,且在突变系和保持系中序列一致。Bc AP3-2基因在突变系中克隆到的c DNA全长为698 bp,编码231个氨基酸;而在保持系中克隆到的c DNA全长为674 bp,编码223个氨基酸。生物信息学分析结果表明:Bc AP3基因属于典型的MADS-box基因家族的Ⅱ类MIKCc-型基因,属于eu AP3家系。不同花器官RT-PCR结果表明:Bc AP3-1基因在2种材料的花瓣和雄蕊中均有表达,而Bc AP3-2只在突变系的雄蕊中表达,在保持系雄蕊中无表达。花发育不同时期RT-PCR结果表明:在突变系中,Bc AP3-2基因的表达量变化与雄蕊退化现象相一致。[结论]Bc AP3-2基因可能与不结球白菜雄蕊瓣化性状密切相关。

不结球白菜开花基因BcFT的亚细胞定位及其互作蛋白的筛选

[目的]开花基因FT是开花通路下游关键基因。本文旨在研究不结球白菜BcFT的亚细胞定位及互作蛋白的筛选,深入了解不结球白菜BcFT的功能及其调控机制。[方法]构建亚细胞定位载体p EZS-NL-BcFT,利用亚细胞定位技术研究BcFT的空间表达。通过酵母双杂交技术筛选与BcFT互作的蛋白,构建酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-BcFT,转化酵母Y2H Gold菌株,验证自激活性和自毒性。对不结球白菜酵母双杂交c DNA文库进行筛选,得到与BcFT互作的片段,并根据基因片段进行比对,以不结球白菜c DNA为模板进行基因全长克隆,构建p GADT7载体,进行共转化验证,最后对筛选得到的2个蛋白进行生物信息学分析。[结果]BcFT蛋白在整个细胞中均有分布。诱饵载体p GBKT7-BcFT表达产物对酵母细胞无自激活性和自毒性,通过酵母双杂交及共转验证得到2个与BcFT互作的蛋白:Bc PPD5和Bc VHA-E1。生物信息学分析预测这2个蛋白均为亲水性蛋白,不含信号肽,Bc PPD5蛋白的氨基酸序列存在1个跨膜区,二级结构中不规则卷曲所占比例最大,第163和296氨基酸残基之间存在1个Psb P结构域;Bc VHA-E1蛋白无跨膜区,二级结构中α螺旋所占比例最大,无特定结构域。[结论]确定了BcFT蛋白在整个细胞中均有表达。利用酵母双杂交技术筛选得到2个与BcFT互作蛋白,进一步分析发现其可能通过光周期路径影响开花。

不结球白菜BcOPR3基因的克隆与功能分析

[目的]12-氧-植物二烯酸还原酶(12-oxo-phytodienoic acid reductase,OPR)是茉莉酸生物合成途径的关键酶,催化12-氧-植物二烯(OPDA)还原反应生成茉莉酸化合物,广泛参与植物生长过程中的防御系统。本文旨在克隆和研究不结球白菜Bc OPR3基因,研究其对信号分子和非生物胁迫应答的影响。[方法]对不结球白菜OPR3基因进行克隆、生物信息分析、亚细胞定位,并对其在霜霉病菌、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、机械伤害、低温和热激胁迫下的表达水平进行了分析。[结果]Bc OPR3在2个不结球白菜品种中的序列一致,其Bc OPR3蛋白与同科油菜(Brassica napus)的同源性高达98%,进化关系与之最相近;亚细胞定位结果显示Bc OPR3定位在细胞膜上;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测结果表明,不结球白菜霜霉病菌、ABA、JA、SA、机械伤害、低温和热激胁迫均能诱导Bc OPR3基因表达。霜霉病菌侵染下,Bc OPR3在抗性自交系‘苏州青’和感病自交系‘矮脚黄’中存在差异表达,并且在抗病自交系中表达量较高。[结论]从不结球白菜克隆得到的Bc OPR3,通过表达分析发现,Bc OPR3可能存在对非生物胁迫的共响应,且在不结球白菜中该基因是在细胞膜上起作用。在非生物胁迫下,基因具有不同的应答模式,抗性自交系Bc OPR3基因的高表达是其具有更高抗性的主要原因。