葡萄抗病毒双价RNAi植物表达载体构建及其对烟草的遗传转化

【目的】为获得兼抗2种葡萄病毒的抗病植物新材料,【方法】利用Gateway技术成功构建了葡萄抗病毒双价RNAi表达载体。先采用RT-PCR分别克隆获得了葡萄卷叶病毒(GLRaV-3)和扇叶病毒(GFLV)外壳蛋白基因保守区段,用重叠延伸PCR方法串联获得了干扰片段GLRaV-GFLV(508 bp);通过TOPO克隆将该片段克隆入载体pENTR/SD/D构建了入门克隆载体pENTR/SD/D-GLRaV-GFLV;再经过LR反应使入门克隆载体pENTR/SD/D-GLRaV-GFLV上的干扰片段GLRaV-GFLV替换目标载体pH7GWIWG2(Ⅰ)上的ccdB基因,形成了含2种葡萄病毒基因片段的RNAi表达载体pH7GWIWG2(Ⅰ)-GLRaV-GFLV,用冻融法将其转入农杆菌菌株EHA105,以此作为工程菌进行转化烟草,【结果】经PCR鉴定证明目的片段已成功转入烟草中。【结论】研究基于Gateway技术的RNAi植物表达载体的构建和对烟草的遗传转化,为诱导转基因植物转录后基因沉默、获得抗2种病毒病的植物新材料提供了可能。