斑马鱼迟缓爱德华氏菌的鉴定、致病性及药物敏感性

从患病斑马鱼(Danio rerio)肝脏组织分离到菌株Z1,通过对该菌株形态特征、生理生化特性、ATB系统鉴定和16S rRNA、DNA促旋酶B亚单位蛋白(gyrB)基因测序等综合分析,鉴定Z1菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。Z1菌株对健康斑马鱼和透明四带无须鲃(Puntius tetrazona)人工感染试验发现,感染发病症状与自然发病症状一致,再分离菌株的特性与Z1菌株相同,并再次感染成功,证实迟缓爱德华氏菌为斑马鱼病原菌。药敏试验发现Z1菌株对呋喃妥因等11种药物敏感,对苯唑西林等6种药物耐受。15种中草药对Z1菌株的体外抑菌试验结果发现,五倍子、石榴皮的抑菌作用明显,最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)均≤6.25 mg/mL;艾叶等有一定抑菌作用,MIC和MBC均在25～200 mg/mL;而野菊花等抑菌作用不明显,MBC>200 mg/mL。

一株多重耐药鳗源肺炎克雷伯菌的分离鉴定

从患病花鳗鲡(Anguilla marmorata)的肝脏分离纯化到一株革兰氏阴性杆菌HM2。人工感染试验结果显示,HM2具有较强的致病力,96h的LD50为9.98×107CFU/mL。经细菌培养特性、生理生化特性和ATBExpression半自动细菌鉴定仪鉴定,结果符合肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的特征。以细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,获得大小为1393 bp的部分16S rRNA基因序列(Genbank登录号为JX282908),将所测序列与GenBank中的序列进行BLAST比对并构建系统进化树,结果表明其与肺炎克雷伯菌的同源性最高(100%),在系统发育树上与肺炎克雷伯菌聚为一簇,进一步确定菌株HM2为肺炎克雷伯菌。药物敏感性试验显示,HM2对亚胺培南、链霉素、阿米卡星3种药物敏感,对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻吩、头孢曲松、头孢噻肟、头孢西丁、复合磺胺、磺胺甲基异恶唑/甲氧苄啶、利福平、萘啶酸、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、呋喃妥因、四环素、多西环素、氯霉素17种药物具有耐药性。研究结果为指导临床合理用药提供了科学依据。

水产动物源嗜水气单胞菌药物敏感性及QRDR基因突变分析

为了解临床分离的59株嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物的耐药性及其靶基因gyrA和parC编码的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的突变情况。采用纸片琼脂扩散法测定15种抗菌药物对水产动物源嗜水气单胞菌的耐药情况,采用PCR法扩增gyrA和parC,并通过测序分析其靶基因突变情况。结果表明:24株(40.7%)嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药,其中对萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星的耐药率依次为40.7%、16.9%、20.3%、8.5%。敏感菌株QRDR靶位点未发生突变,24株喹诺酮类耐药菌株中gyrA基因编码的第83位氨基酸均存在Ser→Ile突变;19株菌parC基因编码的第87位氨基酸也发生突变,其中18株为Ser→Ile突变,1株为Ser→Arg突变,有5株未检测到突变;ParC亚基氨基酸突变的菌株其GyrA亚基均同时发生氨基酸突变。表明临床分离的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药程度不一,其中萘啶酸的耐药最为严重,诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星敏感性较高。喹诺酮类耐药菌株GyrA亚基QRDR氨基酸突变,可能是引起萘啶酸耐药的主要原因。临床分离嗜水气单胞菌QRDR区域的突变具有随机性,但靶位点GyrA的Ser83→Ile以及ParC的Ser87→Ile是最主要的突变方式,另外喹诺酮类药物耐药性的产生可能还与其他耐药机制存在关联。

大黄鱼假单胞菌病病原的分离鉴定及药物敏感试验

于2009、2010年分别从浙江温州南麂岛网箱养殖的患病大黄鱼体内分离出优势菌株ZSH和DHY10051103K,人工感染试验证实其为大黄鱼的病原菌,其半数致死量(LD50)分别为2.5×106、3.2×106CFU/mL。对分离菌株进行了形态、生理生化特性的测定及16S rRNA分子鉴定,结果显示:分离菌株为革兰氏阴性短杆菌,氧化酶阳性;利用柠檬酸盐和麦芽糖,降解硝酸盐,精氨酸双水解酶阳性,甲基红试验阴性,明胶酶阴性,鸟氨酸脱羧酶阴性;在16S rRNA系统发育树中,分离菌株与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)聚为一支,GenBank中序列登录号分别为HQ007288、GQ449379。由此可知,分离菌株属于恶臭假单胞菌(P.putida)。药物敏感性试验结果表明,分离菌株对强力霉素、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、左旋氧氟沙星、氧氟沙星、阿米卡星、诺氟沙星、恩诺沙星、四环素等10种药物敏感;五倍子和石榴皮对其抑菌效果最好,MIC值分别为1.57、3.13 mg/mL,其次为黄连和黄芩,而大黄、白头翁、苦参、黄柏对其抑菌效果较弱。药物敏感性试验结果可以为大黄鱼假单胞菌病的防治提供参考。

五条鰤源美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的分离鉴定及药物敏感试验

2007年5月广东汕尾红海湾网箱养殖的五条鰤爆发主要症状为脾脏、肾脏出现许多灰白色小结节的疾病。从病鱼体内分离出1株优势菌株,命名为SWZX5,为革兰氏阴性杆菌。SWZX5对剑尾鱼有强致病性,其半数致死量为5.8×105CFU/g。综合细菌在形态、生理生化特性及16S rRNA系统发育树等方面的研究结果,确认分离菌株SWZX5属于美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.piscicida)。15种中草药提取液的抑菌和杀菌试验显示,五倍子的功效最好,MIC和MBC均为0.05mg/mL;其次是黄连、石榴皮,两者MIC均为0.20 mg/mL,MBC均为0.40 mg/mL;黄芪功效较差。20种化学抗菌类药物的抑菌试验显示,分离菌株SWZX5对供试的氨曲南、恩诺沙星、左旋氧氟沙星、头孢呋辛钠等16种抗菌药物敏感;对卡那霉素、苯唑西林等4种抗菌药物中度敏感或耐药。

磺胺间甲氧嘧啶在罗非鱼体内的药物代谢动力学及休药期

在试验水温(28±2)℃条件下,按200mg/kg的剂量对吉富罗非鱼单次药饵饲喂磺胺间甲氧嘧啶(SMM)后,采用HPLC法测定各组织中的药物浓度,研究SMM在罗非鱼体内的药代动力学及消除规律。结果显示,药物在各组织(血液、肌肉、肝脏和肾脏)中的最大峰质量浓度(质量分数)Cmax分别为22.66、7.13、45.50、22.77μg/mL(μg/g);达峰时间Tmax分别为7.52、7.02、1.00/8.00和2.00/10.00h(Tmax 1/Tmax 2);肝、肾组织中的药-时曲线有明显的双峰现象,并且第1个峰浓度高于第2个峰浓度,提示该药物在罗非鱼胃肠道中具有非齐性吸收现象;药物在各组织中(血液、肌肉、肝脏和肾脏)的消除半衰期T1/2Ke分别为5.21、4.84、14.12、6.80h,显示SMM在罗非鱼体内代谢较快,属于较为短效的磺胺类药物;并且在肌肉和血液中的消除快于肝脏、肾脏。在(28±2)℃温度条件下,按200mg/kg的剂量对罗非鱼连续5d药饵饲喂SMM,研究药物的消除规律;根据罗非鱼可食性组织肌肉的残留检测结果,参考中华人民共和国第235号公告中对动物源性食品中磺胺类药物总量的MRL规定,以0.1mg/kg为残留限量,建议休药期不低于5d。

渔用疫苗发展现状及趋势

分析了国内外渔用疫苗产品研发与应用现状,目前全球超过140种疫苗获得生产许可,中国渔用疫苗相关研究涉及病原27种(类)。未来水生动物疫苗佐剂、抗原载体技术、规模化生产工艺和水产免疫基础等方面将成为研究热点,浸泡口服、多联多价疫苗及区域差异化免疫方案等将成为重要的技术需求,渔用疫苗将为水产动物疫病防治发挥重要作用。

渔用芽孢杆菌制剂中菌株的分离与鉴定

为了解不同剂型渔用芽孢杆菌制剂中优势菌株情况,本研究对市售4种不同类型、使用效果良好的芽孢杆菌制剂进行培养分离、革兰氏染色和16S r RNA测序鉴定。结果显示:酶制剂中地衣芽孢杆菌为优势菌群,饲料添加剂中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为主要菌群,复合菌中地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌为主要菌群,粬种中的主要菌群为地衣芽孢杆菌。据结果推测,地衣芽孢杆菌为目前水产养殖业较为普遍使用的芽孢杆菌。

大口黑鲈虹彩病毒双重PCR检测方法的建立

为同时检测患病大口黑鲈中不同属虹彩病毒感染和带毒情况,针对蛙病毒属和肿大细胞病毒属大口黑鲈虹彩病毒主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因的序列,分别设计1对特异性引物Rana-mcp F/R和Mega-mcp F/R,扩增产物片段大小分别为475 bp和262 bp。通过PCR反应体系的优化、反应的特异性和灵敏度试验,建立一种可以同时检测大口黑鲈蛙病毒属和肿大细胞病毒属虹彩病毒感染的双重PCR检测方法,最低DNA检测量分别为6.5 pg和14.5 pg。用此方法,对临床获得的15个大口黑鲈样品进行双重PCR检测和序列测定,获得5个蛙病毒属和1个肿大细胞病毒属虹彩病毒检测阳性结果。本研究中建立的基于MCP基因的大口黑鲈虹彩病毒双重PCR检测方法,可用于养殖大口黑鲈虹彩病毒病快速鉴别诊断和分子流行病学调查。

锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定

2013年4月,广东省一锦鲤养殖场暴发不明病因疾病,濒死锦鲤在塘边游动缓慢直至死亡,死亡率高达100%。现场采样发现,发病锦鲤体长25 cm,眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑点,解剖发现内脏器官包括肝、脾、肾肿大。细菌分离结果显示,内脏器官肝脏和肾脏中未分离到细菌。提取自然发病鱼的肝、脾、肾、鳃组织DNA作为模板,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物。NCBI的Blast搜索结果显示,扩增序列与KHV胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因核苷酸序列同源性为99%。病鱼内脏组织研磨过滤除菌后,腹腔注射20尾锦鲤,可复制出与自然发病相似的症状,并于7 d内全部死亡。取病鱼的鳃和肾脏研磨过滤除菌后进行细胞感染实验,结果显示,组织滤液感染CCB细胞后,盲传5代可以观察到典型的细胞病变效应(CPE)。将出现典型CPE的CCB细胞进行超薄切片制备和电镜观察,电镜下病毒呈对称20面体,直径约100 nm。将出现典型CPE的细胞进行间接免疫荧光实验,可以观察到特异性荧光。根据TK基因全长序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,暂命名为KHV-GZ1301株。研究结果可为KHV起源进化、分类以及疾病防控提供重要材料。

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型在不同鱼类细胞中的增殖情况

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型（GCRVⅡ）是当前导致草鱼出血病流行和暴发的主要基因型,本研究拟通过分析GCRVⅡ代表株HZ08在不同鱼类细胞中的增殖情况来筛选GCRVⅡ的敏感细胞系。首先以不同浓度的HZ08株接种草鱼吻端成纤维细胞（PSF）和草鱼鳔细胞（GSB）,以确定病毒接种的最佳浓度;然后以最佳接种浓度同时感染PSF、GSB、草鱼肝细胞（L8824）、草鱼卵巢细胞（CO）等10种鱼类细胞,接毒后每天观察细胞状态,用荧光定量PCR（q PCR）方法定量分析HZ08在各种细胞系中的增殖量,并在感染5 d后用间接免疫荧光定性分析病毒在各种细胞中的增殖情况。结果显示,HZ08感染细胞的最佳接种浓度为1.0×10^4拷贝/μL,该毒株接种的10种鱼类细胞均无明显的细胞病变效应（CPE）;q PCR分析病毒感染5~8 d后的结果显示,HZ08在GSB、L8824、PSF、草鱼鳍条细胞（CF）、CO、草鱼脑细胞（CIB）、锦鲤吻端细胞（KS）7种细胞中均能增殖,其中在GSB、L8824和PSF细胞中的增殖量较大,最大分别为1.14×10^7、5.90×10^6和6.30×10^4拷贝/μL。而在鲤上皮细胞（EPC）、锦鲤脑细胞（KB）、鲫脑细胞（Cc B）中不增殖,免疫荧光定性检测结果与荧光定量检测结果相吻合,在GSB、L8824和PSF中的荧光信号较多、较强,其他细胞中则较弱或没有荧光信号。研究表明,GSB、L8824和PSF是GCRVⅡ较为敏感的细胞系,该研究结果对今后Ⅱ型GCRV的研究和防控产品开发具有重要意义。

鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕的构建及制备条件优化

菌蜕具有完整细菌表面抗原结构,可诱导机体的体液和细胞免疫应答,成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性,实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体,转化迟缓爱德华氏菌,成功制备其菌蜕,并对菌蜕形态、溶菌动力学、裂解效率以及制备条件等进行了研究。结果表明,细菌菌蜕表面形成溶菌孔道,细胞因内容物流失而发生明显的皱缩;构建的迟缓爱德华氏菌诱导后1 h开始裂解,5 h后裂解基本完成,裂解效率为99.99%,冷冻干燥后重悬涂布平板,未检出活菌,电镜观察表明冻干前后细胞形态未见明显变化;构建的迟缓爱德华氏菌分别在OD600值为0.4和0.6进行诱导,其裂解过程和裂解效率没有明显区别;分别用LB、BHI、NB 3种培养基进行比较研究,其中LB培养基制备的菌蜕细胞较完整、裂解完全,是制备迟缓爱德华氏菌菌蜕最优培养基。本研究成功构建了鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕,并对其制备条件进行了优化,为鳗鲡爱德华氏菌病疫苗开发奠定了基础。

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。

鱼致病性舒伯特气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为快速准确鉴别检测鳢源致病性舒伯特气单胞菌(A.schubertii),本实验根据该菌的促旋酶B亚单位基因(gyrB)、溶血素基因(hlyA)的保守序列设计引物,建立了检测致病性A.schubertii的双重PCR方法。结果显示gyrB和hlyA基因扩增产物分别为601 bp和375 bp;其最低检出菌体DNA量为2.3×10-2ng,最低检出菌数为3×102cfu。特异性试验结果显示,该方法对温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞菌、柱状黄杆菌、哈氏弧菌以及类志贺邻单胞菌扩增结果均为阴性。应用该方法对37份临床病料样品的检测结果与传统细菌分离鉴定结果的符合率为100%,表明该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于A.schubertii的快速检测和流行病学研究。

嗜水气单胞菌毒力因子检测及不同毒力基因型菌株对剑尾鱼的致病性研究

选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)的4种主要胞外毒力因子(气溶素、溶血素、胞外蛋白酶和细胞毒性肠毒)设计合成4对引物,对2008—2009年广东、江西两省的临床分离菌株进行检测,评价菌株毒力基因的分布特征及其毒力强弱。60株临床分离株中,具有4种毒力基因(aer+hly A+epa+act+)的菌株占58.33%(35/60),是主要毒力基因型;其他25株的毒力基因有不同数量缺失。不同基因型的代表菌株对剑尾鱼攻击试验结果表明,嗜水气单胞菌毒力因子之间表现出协同作用,aer+hly A+epa+act+型的毒力最强,对剑尾鱼的致死率最高。

基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan Real-Time PCR检测方法的建立及应用

为了建立和应用可检测基因I型草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的荧光定量检测方法，实验根据基因I型GCRV的s6保守序列，分别设计扩增目的条带661bp普通引物（P1、P2）、扩增目的条带159bp荧光定量引物（F1、F2）和一条探针；同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒，10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线（Y=-3．389X＋38．076）。结果表明，此方法在3．9×10^7～3．9×10^1拷贝／uL之间相关性较好，R2为0．992，最小检测量为4拷贝／uL；且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品，阳性结果为4份；而普通PCR检测仅2份显示阳性。本研究建立了针对基因I型GCRV的荧光定量检测方法，具有高效、特异、灵敏、可重复性强的优点，适合于目前基因I型GCRV的临床快速检测和病毒定量分析。

草鱼呼肠孤病毒分子生物学研究进展

由草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病是危害我国淡水养殖业,尤其是草鱼养殖业最为重要的疫病,论文就近年来国内外对草鱼呼肠孤病毒一般生物学特性、基因组特征、蛋白及其功能、细胞培养特性、致病机理、分子生物学诊断技术等各方面的研究进展进行综述,为草鱼呼肠孤病毒的进一步深入研究和草鱼出血病的防控提供参考。

草鱼呼肠病毒研究进展

由草鱼呼肠病毒引起的草鱼出血病是一种高度传染性与致死性的病毒性疾病,该病的频繁暴发给我国草鱼养殖业及淡水养殖业造成了巨大的经济损失。论文就近年来对草鱼呼肠病毒在基因组序列及基因分型、流行病学、先天性免疫、检测方法、免疫防控等方面的研究进行综述,以期为草鱼呼肠病毒的研究提供借鉴和参考,为草鱼出血病预防和控制提供帮助。

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)是当前引起草鱼出血病暴发与流行的主要病原,为建立快速检测GCRV-Ⅱ的方法,本研究根据GCRV-ⅡRd Rp基因的保守区域序列设计引物及TaqMan探针,经反应参数优化,建立了检测GCRV-Ⅱ的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法仅对GCRV-Ⅱ的靶基因序列进行扩增,与其它非靶目标核酸均无交叉反应;其最低检出量为3拷贝/μL病毒核酸,比普通PCR的敏感度高100倍;组内和组间重复试验变异系数均小于1%。采用该方法检测60份草鱼出血病疑似样品,GCRV-Ⅱ阳性检出率为75%(45/60),与细胞分离结果一致。应用该方法分析了GCRV-Ⅱ在不同细胞和不同培养方式下病毒的增殖含量,结果显示GSB和PSF细胞增殖量最大,达106拷贝/μL^107拷贝/μL病毒核酸,转瓶接种比常规的细胞培养瓶和培养板接种其病毒含量低2个数量级。本研究建立的GCRV-ⅡTaqMan荧光定量PCR方法具有高效、特异、敏感、可重复性强的优点,适用于GCRV-Ⅱ的临床快速检测和病毒定量分析。

草鱼呼肠孤病毒HZ08株抗体IPMA检测方法的建立及应用

为建立一种检测草鱼呼肠孤病毒HZ08株(HZ08)抗体的免疫学方法,本实验以接种HZ08病毒的细胞培养板为抗原板,以免疫弱毒疫苗的草鱼血清为抗体,通过反应条件优化,建立了检测GCRV HZ08血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)方法,并对该方法特异性、敏感性、重复性、与ELISA检测结果的符合率及对临床血清样品的检测效果等进行了验证。结果显示,HZ08株种毒按照1×103拷贝/μL浓度接种后72h固定,HRP-Ig G二抗1∶1000稀释,待检血清1∶100稀释时效果最佳;该IPMA方法与草鱼阴性血清、免疫细菌三联疫苗的草鱼血清、感染GCRV JX0901(GCRVⅠ型)的草鱼血清无交叉反应;GCRV HZ08株阳性血清稀释至1∶800时仍能检出;批内和批间重复性实验显示,该方法具有良好的重复性;符合性实验结果显示,该IPMA方法与ELSIA方法的阳性和阴性符合率分别为95.7%和87.5%;用建立的IPMA方法检测草鱼出血病弱毒疫苗免疫草鱼,免疫2周后抗体水平达到峰值;对现地送检的126份草鱼血清样本进行检测,平均检出阳性率为72.2%。研究表明,建立的HZ08株IPMA方法特异性强、重复性好、敏感性高,为GCRVⅡ型的流行病学调查、疫苗免疫效果评价及抗原抗体检测提供了一种有效的检测手段。