利用GFP表达系统检测球孢白僵菌侵染昆虫过程

绿色荧光蛋白(GFP)作为一种重要的报告基因,在病原菌和寄主之间的互作研究中具有良好的应用前景。利用草丁膦抗性基因bar为筛选标记,构建了组成性表达绿色荧光蛋白基因egfp的载体pBG,并转入球孢白僵菌获得成功表达。将转化子接种菜青虫进行生物测定表明,组成性表达egfp不影响球孢白僵菌的毒力。进一步利用冰冻切片和荧光显微观察技术监测球孢白僵菌侵染寄主行为,结果显示,通过荧光观察可清楚的检测到病原菌在昆虫体表的附着、菌丝穿透体壁以及菌丝从寄主体内长出等侵染过程。由此表明,GFP可有效用于球孢白僵菌的遗传标记,进行病原菌的鉴别、侵染致病机理及相关功能基因的表达模式研究。

球孢白僵菌Hog1 MAPK同源基因BbHog1的克隆及特征分析

根据几种丝状真菌Hog1 MAPK的保守氨基酸序列设计简并引物,从昆虫病原真菌球孢白僵菌中扩增出MAPK同源基因的部分片段,然后利用YADE法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK编码基因的全长序列,命名为BbHog1。序列分析表明,该基因编码358个氨基酸的多肽,推测分子量为40.99kDa,等电点为5.49。BbHog1含有MAPK保守的蛋白激酶激活域(TGY),序列与粗糙脉孢霉os-2(AF297032)、烟曲霉OSM1(XM_747571)、隐球酵母HOG1(AF243531)和酿酒酵母Hog1(Z73285)等Hog1 MAPK高度同源,相似性分别为94%、89%、83%和80%。系统聚类结果表明,BbHog1与酵母Hog1 MAPK同源。Southern杂交表明,BbHog1在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。Northern分析表明,BbHog1在高渗、亚高温和营养胁迫等条件下的表达明显升高。由此推测,BbHog1基因可能与球孢白僵菌对逆境胁迫的适应性调节密切相关。

球孢白僵菌FUS3/KSS1类MAPK同源基因(BbMPK1)的克隆及特征分析

根据几种丝状真菌FUS3/KSS1类MAPK的保守序列设计简并引物,从昆虫病原真菌球孢白僵菌中扩增出MAPK基因的部分片段,进而利用YADE法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK基因的全长序列,命名为BbMPK1。用3′RACE扩增出BbMPK1的全长cDNA序列,该序列含有一个1071bp的ORF,编码356个氨基酸的多肽,推测分子量为41.2kDa,等电点为6.61。BbMPK1含有11个MAPK共有的蛋白激酶区域和1个MAPK激酶作用的磷酸化位点区域(TEY),其氨基酸序列与丝状真菌的TMKA、PMK1、CMK1、FMK1和BMP1等MAPK高度同源。系统聚类结果表明,BbMPK1属于酵母FUS3/KSS1类MAPK。Southern杂交表明,BbMPK1在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。RT-PCR分析表明BbMPK1在分生孢子休眠阶段、萌发阶段和菌丝生长时期均表达。研究结果为阐明酵母FUS3/KSS1类MAPK同源基因在球孢白僵菌中的作用奠定了基础。

球孢白僵菌丝氨酸蛋白酶基因CDEP-1在毕赤酵母中的表达

我们从球孢白僵菌中克隆了丝氨酸蛋白酶Pr1类基因CDEP-1。为明确CDEP-1的功能、评价其在害虫生物防治中的潜力,需要大量制备具有生物活性的CDEP-1编码蛋白。由于大肠杆菌系统表达真核基因存在产物复性困难的问题,本文利用毕赤酵母系统来表达CDEP-1。结果表明,CDEP-1可在毕赤酵母中高效的分泌表达,而且产物活性高,甲醇诱导48h后上清液中的酶活即可达到38,266U/L。诱导表达的上清液经浓缩后进行凝胶过滤层析,得到了CDEP-1的初纯品,蛋白质含量为50mg/L。将纯化的蛋白酶CDEP-1免疫家兔,制备了CDEP-1的抗血清。Westernblotting分析表明,制备的抗血清可特异性地检测CDEP-1。