实验室检测在羊病防控中的应用

近年来,随着我国养羊业的快速发展,养殖规模不断扩大。但笔者发现养羊业的集约化养殖管理水平和疫病防控技术,与养猪业相比差距较大,呈现规模化粗放式管理现象,导致羊病的种类越来越多,老病新发或新的疾病不断暴发流行,隐性感染、非典型症状和混合感染无处不在,仅靠流行病学、临床症状和病理变化难以确诊,不能及时准确制定防控措施,往往贻误疾病治疗的最佳时机,导致羊群大量死亡。

一例猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型混合感染的实验室诊断

2016年美国报道了一种新型病毒猪圆环病毒3型(Porcine Circovirus 3,PCV3)。随后,包括中国在内的许多国家报道了该病的流行。2018年4月,湖北省襄阳市某猪场送样品至本实验室检测。本实验室利用荧光定量逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)、一步法逆转录PCR(One Step Reverse Transcription PCR,One Step RT-PCR)及多重PCR方法分别检测了猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)、PCV2及PCV3。结果CSFV、PRRSV均为阴性。PCV2、PCV3为阳性且存在混合感染现象。经采取综合防控措施后,本次疫情得到控制。

茶黄素体外抑菌作用研究

通过体外试验研究茶黄素对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠球菌、禽肺炎克雷伯、鸭源鸡杆菌、禽肠炎沙门氏菌、野鸟黏质沙雷氏菌、禽巴氏杆菌的抑菌作用。采用最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定法研究茶黄素的抑菌作用及杀菌作用。结果显示,茶黄素对禽巴氏杆菌、鸭源鸡杆菌等具有抑菌作用,并与其浓度呈正相关,而对大肠埃希氏菌、禽肠炎沙门氏菌、黏质沙雷氏菌等无作用;茶黄素浓度为128μg/mL时,其对鸭源鸡杆菌生长具有抑制作用,当茶黄素浓度为512μg/mL时,其对禽巴氏杆菌C48-1生长具有抑制作用;当茶黄素浓度为512μg/mL时,其对禽巴氏杆菌和鸭源鸡杆菌具有杀菌作用。茶黄素在MBC浓度时能抑制生物被膜的形成能力。结果表明,茶黄素是一种天然抗菌剂,具有优良的替抗前景,促进绿色健康养殖。

我国猪群中多杀性巴氏杆菌的基因型分析

本研究旨在了解我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌(Pm)的主要基因型。利用荚膜基因分型、脂多糖(LPS)基因分型、多位点序列分型(MLST)对2013年12月—2017年12月4年间来源于我国各地区规模化猪场患有疑似呼吸系统疾病的病死猪肺、鼻拭子、气管、肝等样品中分离鉴定的Pm进行基因型分析,并对23种主要毒力基因进行检测。结果表明,当前在我国猪群中流行的Pm的荚膜基因型为A(48.85%)、D(42.75%)、F(2.67%),优势基因型为A和D;LPS基因型为L3(25.00%)和L6(75.00%)型,优势基因型为L6;MLST基因型为ST3(21.25%)、ST10(27.50%)、ST11(42.50%)、ST12(2.50%)、ST16(2.50%)、ST74(1.25%)及ST75(2.50%),优势基因型为ST3、ST10和ST11。如果将荚膜基因型、LPS基因型和MLST基因型组合起来看,当前在我国猪群中流行的Pm的主要基因型为荚膜:脂多糖:MLST基因型A:L3:ST3(20.00%)、A:L6:ST10(26.25%)及D:L6:ST11(42.50%)。毒力基因检测的结果发现部分毒力基因的分布表现出一定的"基因型偏好性"。结果提示,D:L6:ST11是我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌的主要基因型,可能与我国猪群中由多杀性巴氏杆菌导致的呼吸道疾病密切相关。

仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的研制与应用

为了研制仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗,将大肠埃希菌C83549(K88)、C83644(K99)、C83710(987P)菌株和C型产气荚膜梭菌C59-2菌株分别接种适宜培养基,提取大肠埃希菌纤毛和C型产气荚膜梭菌外毒素,灭活和脱毒后加入冻干保护剂,冷冻干燥制成冻干灭活疫苗。该疫苗性状为类白色海绵状疏松团块,无菌检验合格,疫苗对仔猪和怀孕母猪安全,怀孕母猪免疫该疫苗后所产仔猪对大肠埃希菌和C型产气荚膜梭菌的攻毒保护率均在80%以上。临床应用结果表明,该疫苗能明显提高免疫母猪的窝平仔猪成活数。

仔猪大肠杆菌纤毛抗原反向间接血凝检测方法的建立与应用

为建立大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的快速鉴别诊断和定量检测方法,用纯化的大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原免疫家兔制备阳性血清,其琼扩效价分别达到1∶32、1∶32、1∶128;利用该阳性血清IgG致敏醛化的绵羊红细胞,确定了最适K88、K99、987P阳性血清IgG的质量浓度分别为40、160、80μg/mL。用该方法对同一批次的K88、K99和987P纤毛抗原进行3次检测,K88、K99和987P纤毛样品的RIHA效价均为1∶1 600、1∶1 600和1∶800。结果表明,该检测方法具有较好的特异性和可重复性,可用于大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的快速鉴别诊断。

猪伪狂犬病抗体检测与分析

为了调查湖北省规模化猪场猪伪狂犬病病毒（PRV）免疫抗体水平和野毒感染情况,试验应用猪PRV gB和PRV gE抗体ELISA检测试剂盒对采集的湖北省11个市（州）的16个规模化猪场的1 109份血清样品按照不同猪场、不同地区和不同生长阶段三个方面进行了PRV gB和PRV gE抗体的检测（包括阳性数和阳性率）,并对检测结果进行统计分析。结果表明：被检测的16个猪场中有12个为野毒阳性感染场,占比为75%。在不同猪场,PRV gB阳性样品数为953份,阳性率为85. 93%; PRV gE阳性样品数为223份,阳性率为20. 11%; PRV gB抗体阳性率与PRV gE抗体阳性率呈显著负相关。在不同地区,PRV gB抗体阳性率最高的地区为鄂中,为90. 36%; PRV gE抗体阳性率最高的地区为鄂东,为30. 75%。在不同生长阶段,PRV gB抗体阳性率最高的猪为后备母猪,为93. 06%; PRV gE抗体阳性率最高的猪为经产母猪,为30. 38%。

乳胶凝集试验快速检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的研究

通过将羧化聚苯乙烯乳胶与大肠杆菌O157:H7 Intimin蛋白单克隆抗体进行偶联,对最佳偶联抗体IgG量、最佳偶联时间等条件进行优化,建立了快速检测大肠杆菌O157:H7的乳胶凝集试验方法。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异、简便等优点,适于临床应用,为大肠杆菌O157:H7的快速诊断提供了技术支撑。

羊口疮病毒湖北株B2L基因的克隆与遗传进化分析

为了分析羊口疮病毒湖北株(ORFV-HB-YX株)B2L基因遗传变化规律,参照Gen Bank公布的ORFV-B2L基因序列设计特异性引物,对ORFV-HB株B2L基因进行PCR扩增、克隆、测序以及遗传进化分析。结果显示,B2L基因PCR扩增产物大小为1 137 bp,编码379个氨基酸,系统进化树显示HB-YX株与Gen Bank参考毒株的核苷酸序列同源性为97.0%~99.0%,与福建FJ-GS株同源性高达99%亲缘关系最近,属于同一分支。

鸭坦布苏病毒E蛋白原核表达及反应原性分析

参照Gen Bank已发表的鸭坦布苏病毒序列,采用生物信息学分析并利用PCR方法从鸭坦布苏病毒湖北分离株(JL2011株)扩增出E基因全长片段(E1)及E基因截短片段(E2),将含有双酶切位点的目的片段连接p ET-28a(+)载体,成功构建出重组表达质粒p ET28a-E1和p ET28a-E2。将p ET28a-E转化BL21(DE3)后,经IPTG诱导可表达出约54.3 ku和44.8 ku的蛋白,但E2的表达量明显高于E1,故将筛选的E2包涵体进行纯化后,用坦布苏病毒阳性血清进行Western blot分析表明纯化后的重组蛋白具有良好的反应原性。研究为进一步阐明鸭坦布苏病毒E蛋白的功能及建立快速灵敏的鸭坦布苏病毒检测方法奠定基础。

猪瘟疫苗免疫抗体检测与分析

为评估湖北洪湖某猪场猪瘟疫苗的免疫效果,研究采用猪瘟ELISA抗体检测试剂盒,对该猪场种猪及不同日龄商品猪的猪瘟疫苗免疫抗体水平进行了检测与分析,结果显示种猪的抗体阳性率均达到97%以上,猪瘟疫苗首免前哺乳仔猪的母源抗体阳性率为67%,疫苗首免后21 d免疫抗体阳性率为54%,二免后21 d免疫抗体阳性率为93%。表明该猪场哺乳仔猪在猪瘟疫苗首免时,母源抗体水平较高,导致首免后猪瘟抗体水平提高缓慢,免疫抗体效价较低,整齐度较差,应及时调整和优化免疫程序。

鸡白痢沙门菌RcsB蛋白的致病性及生物学特性研究

为研究rcsB基因缺失对鸡白痢沙门菌的致病性作用,通过Red同源重组、动物体外及体内试验比较亲本株和缺失株的致病性及生物学特性。结果显示:rcsB基因缺失后,亲本株的生长速度减慢,对肠上皮细胞黏附与侵入能力显著降低,对2日龄SPF鸡的致死性减弱以及在宿主体内生存能力也显著降低。研究调控因子RcsB对致病性的调控机制,可为防控鸡白痢沙门菌病的致病作用等提供了前期数据支撑。

禽巴氏杆菌四环素耐药株转录组测序与分析

为鉴定禽源多杀性巴氏杆菌(avian Pasteurella multocida,Pm)四环素(Tetracycline,Tet)敏感株与耐药株(MIC=32μg/mL)在转录组水平上的差异,本研究采用RNA-seq技术对Tet敏感株与耐药株进行双向测序,通过GO、KEGG和ARDB数据库对表达差异基因进行注释和富集性分析。结果显示,共筛选出442个差异表达基因,其中包括103个上调基因和339个下调基因。通过GO功能富集分析显示差异表达基因多数富集于核糖体结构成分、rRNA结合、跨膜运输和离子转运等生物过程;对差异表达基因进行信号通路富集性分析,大多数差异表达基因分布在ABC转运蛋白与核糖体代谢途径中;对差异表达基因进行耐药基因注释(ARDB),发现其中的耐药基因主要为核糖体保护蛋白和外排系统两类。本研究表明禽源Pm对四环素耐药的耐药机制可能与细胞膜上ABC转运蛋白的过量表达以及核糖体保护蛋白有关。

规模化养殖场带畜消毒剂的选择和使用方法

随着我国养殖场现代化程度越来越高,饲养规模也越来越大,动物疾病呈现传播快、危害大的趋势,保障养殖场外界环境生物安全是切断疫病传播的最佳方式,因此做好养殖场的日常消毒工作尤为重要。要做好消毒工作,首先要正确选择和使用消毒剂,但目前市场上消毒药品的品种繁多,消毒对象不同选择的消毒药种类也不同,尤其带畜消毒,在养殖场中的消毒面积和使用量也是最大。

耐氟喹诺酮类药物禽源大肠埃希菌gyrA基因的检测分析

探讨不同禽源大肠埃希菌中喹诺酮类药物的耐药情况及耐药基因gyrA的分布和突变特征。采用K-B药敏纸片法、gyrA基因的PCR扩增,对9株大肠埃希菌进行喹诺酮类药物试验,并将gyrA基因的PCR产物测序,对测序结果采用DNA MAN、DNA Star、MEGA6等软件分析。药敏试验结果表明,C1、C2、C3菌株对左氧沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星敏感,D1、D2、D3、B1、B2和B3菌株对左氧沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星均表现为耐药和中介;gyrA基因的测序结果表明,除B1菌株有1处核苷酸突变位点和B2菌株有14处核苷酸突变位点;B2菌株gyrA基因的氨基酸突变发生在87位Ile→Val替代、101位Leu→Met替代、102位Ala→Ser替代、129位Lys→Gln替代。9株禽源大肠埃希菌的同源性和进化树分析表明,不同禽源耐氟喹诺酮类药物的大肠埃希菌菌株中B2菌株gyrA基因与其他9株菌株相比,同源性在90%左右,进化树不在一个分支上,研究中的B2菌株将为大肠埃希菌的氟喹诺酮类耐药机制的研究提供候选菌株。

生物膜、毒力基因和耐药基因对APEC的致病性作用

禽致病性大肠杆菌病(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)是危害养禽业发展的主要细菌性病原之一,给养禽业的发展带来了严重危害。为研究APEC的致病性与耐药性之间的关系,从毒力基因的分布、生物膜的形成能力、耐药基因的分布等三个方面探讨了生物膜的形成能力与毒力基因、耐药基因在致病性中的作用,为后期研究禽大肠杆菌的致病机理及耐药机制等提供理论基础,并为开展禽大肠杆菌病的流行病学调查及监测、防控禽大肠杆菌病的流行提供理论数据。

不同用途酵母菌株环境适应性差异研究

为明确不同的酵母菌株的环境适应性,以便为工业化生产中筛选理想的菌株,本课题主要研究了6种不同用途的酵母菌株在不同环境胁迫条件下的耐受性,初步分析酵母细胞内Na^+、K^+浓度与环境pH的相关性以及其胞内海藻糖积累量与环境胆酸盐浓度的相关性,并对6株酵母菌株的产气能力进行了比较。结果显示,不同用途的酵母菌株的环境耐受性及产气能力存在差异,不同菌株的酸胁迫耐受性与其细胞内Na^+、K^+浓度变化有密切关系,胆酸盐耐受性与其胞内海藻糖积累量密切相关。研究试验菌株中布拉迪酵母、反刍酵母和畜禽酵母3株酵母菌株的酸胁迫耐受性和胆酸盐耐受性较其余3株酵母菌株强,且6株酵母菌中,反刍酵母、畜禽酵母和布拉迪酵母的产气能力均在中等产气能力以下,故此3种酵母菌株适合作为饲用酵母益生菌株使用。

某规模化猪场伪狂犬病抗体检测与分析

为了掌握湖北省黄冈市某规模化猪场猪伪狂犬病病毒(PRV)免疫抗体水平和野毒感染情况,试验应用猪PRV-gB和PRV-gE抗体ELISA检测试剂盒,对采集的622份血清样品,进行了PRV-gB和PRV-gE抗体的监测,并对3次检测结果进行了统计分析,结果表明:母猪群PRV-gE抗体从20.2%降至7.0%,仔猪及育成猪群PRV-gE抗体从21.8%降至5.0%;母猪群、仔猪和育成猪群PRV-gB抗体阳性率则分别从70.8%、57.3%升至93.0%、96.0%。

乳胶凝集试验快速检测鸭疫里默氏杆菌抗体的研究

将鸭疫里默氏杆菌重组蛋白OmpA致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂,建立一种可快速检测鸭疫里默氏杆菌抗体的检测方法。结果表明,该检测方法快速、敏感、特异,操作简单,适合临床现场快速筛查,对该病的流行病学调查及防控有重要意义。

灰雁黏质沙雷菌的鉴定及其耐药性分析

为研究2016年武汉地区灰雁粪便中所产红色色素的未知菌的类别及其耐药性,经细菌分离、生化鉴定、细菌16SrDNA通用引物等鉴定,确定1株病原菌为黏质沙雷菌。经药敏试验发现黏质沙雷菌对萘啶酸、头孢噻肟、环丙沙星、阿米卡星、复方新诺明、庆大霉素、甲氧嘧啶等敏感,对头孢他啶、氨曲南、氨苄西林等中介,对头孢曲松、四环素、呋喃妥因、链霉素、磺胺异恶唑耐药。了解黏质灰雁沙雷菌的耐药情况,对环境中食源性肠道菌进行监测,为今后禽源沙雷菌抗生素替代药物的开发提供潜在的候选菌株。