桑树种群遗传结构变异分析

基于探讨桑属植物种群间遗传变异规律 ,采用显性分子标记RAPD技术 ,对我国桑树现行分类的 15个种、4个变种及近缘属的 4 8份供试材料进行了桑属种群的遗传结构分析。结果表明 :桑树具有丰富的遗传多样性 ,多态位点百分率为 78 95 % ;Nei′s基因多样性指数 (h)与Shannon多样性指数 (I)具有相同的群体遗传多样性评价结果 ,即种群组成差异越大 ,h与I指数越大 ,桑属种群的h指数为 0 1893,I指数为 0 30 91;桑属种群总基因流值Nm<1(0 5 2 2 0 ) ,基因分化系数Gst为 0 4 75 3;AMOVA分析表明种群内的变异百分率为 72 6 5 % ,种群内的变异大于种群间 ;UPGMA聚类结果与基因流值。

家蚕脂肪体蛋白质组学研究

通过高精度的双向电泳技术对家蚕末龄幼虫的脂肪体组织进行了研究,采用基质辅助质量飞行时间质谱对其中一些表达量较高的蛋白点进行了鉴定,并利用GPMAW软件结合家蚕基因组预测的蛋白质数据库构建了本地的肽质量指纹图谱数据库,对所得到的肽质量指纹图谱进行了分析。研究发现,经过双向凝胶电泳及其图象分析技术,银染可以分离出722个清晰蛋白点,这些蛋白质主要集中在分子量15～90kD区域,等电点pH4～8之间。MALDI-TOF-MS鉴定的41个蛋白点中都有较强的肽质量指纹信号峰,其中34个蛋白点得到了成功鉴定,其中包括了大量参与代谢的酶类、不同分子量的热激蛋白、重要的血液蛋白30K,Actin3等,这一结果对人们进一步认识家蚕脂肪体提供了有利的帮助。

桑树多倍体育种材料遗传背景的AFLP分析

利用AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)分子标记技术 ,即扩增片段长度多态性 ,从DNA分子水平对 19份人工三倍体桑育种材料进行了遗传背景分析 ,构建了指纹图谱。 19份育种材料可组配 70个杂交组合 ,各材料间AFLP相似系数大于 0 75 0 0的有 5 4个组合 ,经AFLP分析认为 ,它们不宜作亲本间杂交组合 ;AFLP相似系数小于 0 75 0 0的有 16个组合 ,经AFLP分析认为它们适于作亲本间杂交组合。

家蚕信息素结合蛋白BmPBP2和BmPBP3基因的初步鉴定及表达分析

嗅觉对昆虫的生存、繁殖等起着重要的作用。依据家蚕Bombyxmori全基因组序列设计特异引物,扩增得到了两个信息素结合蛋白BmPBP2和BmPBP3基因的cDNA片段。结合已报道的家蚕信息素结合蛋白BmPBP1和两个普通气味结合蛋白BmGOBP的信息,对其基因结构分析表明,这5个基因均由3个外显子组成,具有保守的外显子/内含子边界和典型的6个Cys残基,且3个PBP基因在基因组上串联分布。序列同源性分析表明,BmPBP2和BmPBP3与烟草天蛾的PBP2和PBP3的同源性高达69%和63%。半定量RT-PCR分析结果显示,BmPBP2和BmPBP3基因在成虫触角中特异表达,且雌雄表达水平相当。这些结果表明BmPBP2和BmPBP3可能起着性信息素识别的作用。

家蚕中肠组织蛋白质组学研究

通过高精度的双向电泳技术对家蚕5龄幼虫的中肠组织进行了研究,利用基质辅助质量飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)对表达量较高的蛋白点进行了肽质量指纹图谱分析,并采用GPMAW软件对家蚕基因组预测的蛋白质数据库进行了本地构库,对所得到的肽质量指纹图谱进行了分析。结果发现,家蚕中肠蛋白质经过双向凝胶电泳和图像分析,银染后可以检测出600个以上的蛋白点,这些蛋白点主要集中在分子量15～80 kD区域,等电点3～8.5之间。MALD I-TOF MS鉴定的36个蛋白点中都有较强的肽质量指纹信号峰,其中32个蛋白点得到了成功鉴定,包括原肌球蛋白以及大量的离子转运蛋白、与代谢相关的酶、与信号传导和细胞凋亡相关的蛋白等。这一结果为进一步认识家蚕中肠组织的生理功能提供了基础信息。

家蚕基因库突变系统的研究

经过十几年的研究 ,整理了包括最早于 2 0世纪 4 0年代 ,尤其是 80年代后期以来收集、引进、创造的家蚕各种突变基因、染色体变异系统及特色遗传材料 10 0 0余份 ,通过对其进行形态、生理、生化性状的鉴定和遗传分析 ,构建和完善的保存系统有 6 0 0余个家蚕基因的资源库 ,保存的家蚕突变基因种类覆盖国际现存家蚕突变基因的 90 %以上。其中珍稀突变基因达 10 0多个 ,首次发现的突变基因 6 0余个。通过对突变系统进行杂交分析 ,连锁检索和三点测验定位 ,构建了完善的家蚕连锁检索标记体系 ,含全部 2 8个连锁群的标志基因有 2 30个 ;构建了各连锁群的基因定位系统 (隐性基因合成系 ) ;发现了基因互补突变卵色和第三型母性遗传卵色 ,发现了白色卵突变基因上位作用的普遍性。育成了以形态突变基因为标记的、相互独立的近等基因系 2 8个。开发了高饲料效率、性别标记、天然有色茧丝、抗病性、广食性、可控制单性别孵化等一系列有重大应用前景的有用突变基因育种新素材。建立了较为完善的家蚕基因资源持续保存的方法和管理技术体系。

家蚕P450基因CYP18A1的克隆、序列分析及转录活性

蜕皮激素对昆虫生长、发育和繁殖有重要调控作用,尤其对蜕皮和变态过程。利用GenBank上登录的蜕皮激素C26羟基化酶候选基因CYP18A1的氨基酸序列对家蚕Bombyx mori全基因组数据库进行BLASTP比对,发现了家蚕直向同源基因(ortholog),其完全编码序列经RT-PCR检测和克隆、测序验证后,再以此为信息探针检索家蚕表达序列标签(expressed sequence tags,EST)数据库进行拼接延伸,获得了一条包括5′非翻译区在内的长度为1737bp的cDNA序列,验证结果也表明与电子克隆序列完全一致(GenBank登录号为EF421988,P450命名委员会将其命名为CYP18A1)。该基因的开放阅读框为1623bp,编码541个氨基酸,含有包括P450s特征结构域在内的所有昆虫P450基因的5个保守结构域,其推定的分子量为61.67kD,等电点为8.54。将该基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有6个外显子,5个内含子,外显子/内含子边界符合经典的GT-AG规则。同源性分析也发现家蚕CYP18A1与其他昆虫的直向同源基因具有较高相似性。用RT-PCR方法对家蚕主要发育变态时期与组织进行检测,显示出该基因的转录表达不仅具有时空特异性,而且在表达时期上与已报道的蚕体内蜕皮激素含量变化有紧密的一致性。该研究进一步证实了CYP18A1基因与昆虫体内蜕皮激素代谢平衡相关联。

中国野桑蚕和家蚕的AFLP分析

利用AFLP技术和统计学分析原理 ,对我国具有代表性的 10个不同地区野桑蚕和 33个家蚕品种以及 5个作为外群对照的柞蚕品种进行了分子系统学研究。研究结果表明 ,不同地区野桑蚕之间的遗传距离 (0 0 0 0～0 419)与家蚕品种之间的遗传距离 (0 0 0 0～ 0 40 6 )相似 ,而家蚕与野桑蚕之间的遗传距离为 (0 35 5～ 0 5 32 ) ,明显地小于家蚕与柞蚕 (0 76 1～ 0 86 5 )和野桑蚕与柞蚕 (0 776～ 0 839)之间的遗传距离 ,进一步证明了家蚕起源于中国野桑蚕。聚类分析发现 ,中国一化种与二化种聚类在一起 ,中国二化种与热带种聚类在一起 ,热带种不与一化种聚在一个类群 。

野桑蚕和不同家蚕品系幼虫体内1-脱氧野尻霉素含量测定

采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)-紫外检测法测定了野桑蚕和不同品系家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量,并调查了家蚕5龄幼虫不同组织不同生长时期1-DNJ含量的变化。野桑蚕与家蚕、家蚕不同品系间的1-DNJ含量存在极显著差异:野桑蚕全蚕粉中1-DNJ含量最高,质量分数平均为0.427 8%;家蚕以黄血蚕最低,平均0.220 5%。家蚕5龄幼虫不同组织的1-DNJ含量也存在明显差异:家蚕血干粉中的1-DNJ含量最高,质量分数达0.848 7%;其次是中肠、体壁和脂肪体组织,分别为0.512 2%、0.472 2%、0.308 5%;而在丝腺中几乎检测不出1-DNJ。家蚕5龄幼虫体内1-DNJ含量随发育时期呈明显变化,5龄第4天含量最高,达0.329%,第5天以后迅速下降。

桑属ITS、trnL-F、rps16序列与进化分析

【目的】分析桑属ITS、trnL-F、rps16序列,探讨系统学价值。【方法】67份桑资源,经DNA提取、PCR扩增、测序,测序结果用软件拼接、比对,并从GenBank下载桑属ITS、trnL-F、rps16序列进行同源性分析,计算其长度、G+C(或A+T)含量、变异位点、信息位点,将3个序列合并,以构树、柘树为外类群,采用MP法分析进化关系。【结果】桑ITS(包括5.8S)基本序列长度为576 bp,变异范围为576—590 bp,G+C含量为59.55%—62.25%,40个信息位点;trnL-F(包括tRNA-Leu内含子)基本序列长度为923 bp,变异范围为920—924 bp,A+T含量为65.87%—66.31%,23个信息位点;rps16内含子基本序列长度为929 bp,变异范围为923—929 bp,A+T含量为67.28%—67.49%,17个信息位点。3个序列的最适碱基进化模型分别为(GTR+G)、(GTR)和(GTR+G),可能的分支概率—混合卡方概率值分别为0.000001、0.027175和0.000222,3个片段合并最适碱基进化模型为(GTR+G),基于模型用MP法分析,在2 538个位点中,有80个信息位点。分支图结果表明,首先将黑桑(M.nigra)分出,其它桑种分成2支,第一支包括长穗桑、瑞穗桑、蒙桑、鬼桑、鸡桑、山桑、白桑和广东桑,第二支包括华桑、奶桑和川桑。【结论】桑属trnL-F和rps16序列信息位点有限,单独研究桑属系统学,价值不大,与ITS序列合并研究,则能增加分支图的信息位点,使分支图更近于似然。基于ITS、trnL-F、rps16序列MP分支图,新疆黑桑为最原始类型,乌克兰等栽培种为进化类型。

人工三倍体桑树新品种嘉陵20号的选育

嘉陵 2 0号是用化学诱变与人工杂交相结合的染色体工程育成的人工三倍体桑树新品种 (2n =3x =4 2 )。母本为 792 0 (2n =2x =2 8) ,父本为人工四倍体西庆 4号 (2n =4x =5 6 )。该品种营养生长旺盛 ,枝条直立粗长 ,叶形大 ,叶肉肥厚 ,全年公顷产叶量比对照品种湖桑 32号 (2n =2x =2 8)增加 31 81%。养蚕试验万头蚕产茧层量比对照提高 5 84 % ,4 - 5龄蚕 10 0kg桑叶产茧量比对照提高 7 4 5 %。桑叶 (干物 )蛋白质含量 2 7 5 2 % ,比对照高 4 14百分点 ;可溶性糖含量 5 5 3% ,比对照高 1 0 4百分点。

家蚕细胞色素P450基因CYP6AE2的分子克隆与序列分析

为了在分子水平上研究家蚕(Bom byx mori)细胞色素P450基因的特性,更好地探讨该基因与家蚕抗性的相关机制,依据已有的家蚕基因组数据,通过BLASTP比对,选择与抗性相关的6家族中含有预测基因数量最多的CYP6AE亚家族的1条序列,并设计1对引物,用RT-PCR方法克隆了家蚕细胞色素P450家族基因CYP6AE2(Gen-Bank登陆号:EF415296)。该基因的ORF为1 572 bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为60.2 kD,等电点为8.50。将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,结果表明该基因只有1个内含子;与已知的同亚家族基因CYP6AE1(欧洲防风草结网毛虫Depressaria pastinacella)、CYP6AE12(棉铃虫Helicoverpa armigera)编码的氨基酸序列比对,同源性同为53%。

家蚕AFLP分子标记分离规律的研究

为研究家蚕遗传的多样性,以家蚕品种湘晖×872杂交的91个F_2个体为材料,采用AFLP分子标记技术,对杂交后代的分离规律进行了研究。结果显示:采用的44对引物共扩增出5134条带,其中1002条带呈多态性;经x^2检测,有537条带符合3:1分离比。

几种绢丝昆虫遗传多样性的RAPD研究

选用重复性较好的 10个引物对 6种绢丝昆虫 2 3个个体进行扩增 ,共得到 2 45个RAPD标记。RAPD分析结果表明 :家蚕及野桑蚕种内各品种材料的遗传距离较大 ,天蚕、蓖麻蚕及柞蚕较小 ;家蚕与野桑蚕两者之间遗传距离小 ,反映出家蚕和野桑蚕亲缘关系较近 ;而天蚕、蓖麻蚕和柞蚕三者之间以及分别与家蚕和野桑蚕之间的遗传距离较大 ,亲缘关系远。聚类分析的结果与之相同。并且对家蚕的起源及绢丝昆虫遗传多样性的保护利用做了探讨。

SSR标记在中国野桑蚕和家蚕的遗传多态性分析中的应用

采用25个微卫星标记(SSR)对中国5个不同地区的野桑蚕及2个家蚕品种进行了多态性分折,共产生58个等位基因,平均每个位点多于2个等位基因。表明微卫星标记能反映各品种之间丰富的多态性,品种间的聚类结果较好地反映了家蚕和野桑蚕之间的遗传特性。

桑种质资源ITS序列与系统进化分析

目的分析桑ITS序列,为桑系统位置、进化关系、DNA指纹鉴别、育种亲本选择提供分子生物学依据。方法利用收集的73份桑资源,总DNA提取,PCR扩增,测序,并从GenBank下载桑科Moraceae,桑属MorusITS序列,软件分析ITS长度、变异位点、G+C含量、遗传分歧、同源性百分比差异、系统位置与进化关系。结果获得ITS完整序列,基本序列全长576bp,G+C含量59.55%。(ITS1:174bp,G+C含量61.49%,ITS2:302bp,G+C含量62.25%,5.8S:100bp,G+C含量48.00%)。序列比对表明,共166个变异位点,(ITS1:100,ITS2:66,5.8S:0),一些变异位点有明显的种性特征,可作为特异DNA指纹鉴别位点。最大遗传分歧4.0,山桑(M.bombycis)与其它栽培种遗传分歧0.9—1.4。基于ITS桑系统位置,在非洲硬木树(Milicia excelsa,MEU93585)与新西兰鹊肾树(Streblus glaber,DQ499105)之间,与非洲硬木树(MEU93585)亲缘关系最近。Mrbayes分析,新疆黑桑(M.nigra),北美默里桑(M.murrayana,FJ605515)最原始,进化顺序为新疆黑桑,北美默里桑→白桑(M.alba)→华桑(M.cathayana)→长穗桑(M.wittiorum)。结论ITS长度、G+C含量、变异位点均可作桑种质资源DNA特异指纹鉴别的依据,特别是碱基变异位点。桑属劳亚古陆(Laurasia)高纬度起源,由北向南迁移。桑属可由地理分布间接反映系统进化关系。

家蚕化学诱变剂及诱导突变体的筛选

在家蚕Bombyx mori基因组计划完成之后,其功能基因组研究成为该领域的最重要课题。突变体是功能基因组学研究的重要材料,因此,通过人为诱导获取大量的突变系统是及其重要的手段。本研究用化学诱变剂ENU、MNU、DES、5-BU、EMS诱导处理家蚕标准品种C108,筛选获得了非滞育红卵,长圆筒茧、小茧、丝胶茧及绵茧突变体,致死突变体及无鳞毛蛾翅突变体。结果还表明:MNU、DES诱变家蚕的突变效率高,注射翅原基比腹部更方便且效果好,化学诱导雄体比雌体的效果好;在时期上,注射蛹和蛾都有诱导效果。上述突变体大多为致死性突变,推测其可能与致死性基因突变有关。同时,本研究为应用TILLING技术鉴定家蚕更多目的基因突变体提供了有效的材料。

家蚕卵黄原蛋白及其受体基因

家蚕小卵突变体 (Smalleggmutant ,sm) ,其卵体积仅及正常卵的 2 / 3,不能受精而致死。因其卵母细胞不能正常吸收卵黄原蛋白 (Vg) ,人们认为其原因可能是卵黄原蛋白受体基因 (VgR)突变所致。本研究首先通过克隆筛选和基因组序列分析 ,获得了 2 5 6 4bp含有 ployA的家蚕卵黄原蛋白受体基因 (BmVgR)片段。将该基因片段的预测蛋白与其它物种的VgR/YPR和低密度脂蛋白受体 (LDLR)家族比较 ,发现该基因具有LDLR家族的基本结构特征。其次 ,经RT PCR检测 ,结果表明BmVgR在sm的不同时期的卵母细胞中都能正常转录。最后 ,分别对sm不同发育时期的体液和卵的总蛋白进行SDS PAGE分析 ,发现该突变体的卵母细胞不能正常摄取体液蛋白 (包括Vg)。综合分析 ,sm不能正常摄取Vg ,可能并不是VgR的功能异常导致 。

中国野桑蚕和日本野桑蚕的RAPD研究

用RAPD PCR技术初步研究了中国野桑蚕与日本福冈野桑蚕之间的DNA多态性。结果表明 ,不同地域中国野桑蚕个体之间及其与日本福冈野桑蚕个体之间均呈现出丰富的DNA多态性。中国野桑蚕同家蚕共有带率达 3 5 5 % ,同日本福冈野桑蚕为 4 5 1% ,而日本福冈野桑蚕同家蚕为 3 2 % ;中国野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为0 5 2 ,日本野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为 0 6 3,与中国野桑蚕的为 0 5 8,而且与中国沈阳地区野桑蚕之间的遗传距离最近 ,为 0 4 8,以此创建了它们的系统进化树。