水稻种质资源全基因组DNA指纹鉴定方法研究

开展水稻种质资源DNA指纹鉴定可以赋予每份种质统一的身份信息,对于查清我国资源家底、评估资源遗传基础、提高资源利用效率和保护种业知识产权等具有重要意义。本研究利用已完成全基因组DNA重测序的5374份水稻种质资源为材料,通过参考样本资源的选择、高质量SNP位点分析以及最优SNP数量和SNP组合的挑选,建立了2套水稻种质资源全基因组DNA指纹标准。通过主成分分析和系统进化树分析,指纹标准1和2选择的SNP可以代表94,197个高质量群体共有SNP进行群体遗传多样性检测;群体遗传相似度分析验证了指纹标准1和2对于开展水稻种质资源遗传相似性鉴定的有效性。本研究有望为水稻种质资源保护与利用以及种业知识产权保护等提供技术支撑,并为其他作物制定全基因组DNA指纹鉴定标准提供参考。

水稻糯性突变体r162的鉴定与基因定位

直链淀粉是影响稻米食味品质和外观品质的重要因素,主要由Waxy(Wx)基因编码的颗粒结合淀粉合酶Ⅰ(granule-bound starch synthaseⅠ, GBSSⅠ)介导合成。本研究从宁粳2号的甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)诱变材料中筛选到了一个糯性突变体r162,与野生型相比,其籽粒外观呈不透明的云雾状,种子和糙米的粒长、粒宽以及千粒重显著下降。通过扫描电镜对淀粉形态进行观察,发现突变体的淀粉颗粒上存在孔洞。半薄切片碘染结果表明,突变体r162发育时期胚乳的造粉体排列结构与野生型相似,但碘染后颜色更浅。理化性质分析发现,突变体r162的总淀粉、总蛋白质和总脂肪含量与野生型相比无显著差异,但是表观直链淀粉含量极显著下降、胶稠度极显著增加,糊化特性发生明显改变,并且淀粉的崩解值、回生值、回复值以及米粉在尿素中的膨胀体积均小于野生型。通过基因定位和测序发现,突变基因Wx位于第6号染色体短臂上,Wx基因第7个内含子的第1个碱基(Int7-1)由鸟嘌呤(G)替换为腺嘌呤(A),造成Wx基因的编码区存在10个碱基的缺失,导致其编码的GBSSⅠ蛋白自第256位氨基酸起出现错误翻译,使蛋白质翻译提前终止,因此将该等位变异命名为Wx-r162。进一步通过蛋白质印迹法检测发现,突变体中的GBSSⅠ蛋白水平极显著下降。酶活性测定也证实,突变体r162中GBSSⅠ活性明显降低。综上所述,Wx-r162基因被视为一个新的等位变异,这种突变导致GBSSⅠ活性下降,进而造成突变体r162表观直链淀粉含量降低和籽粒表现出不透明的表型。

大豆种子硬实突变体M_(zp661)的鉴定和基因定位

【目的】硬实是种子物理休眠的表现特征,也是大豆驯化的一个重要性状。硬实性虽然有利于种子在不良环境中生存,但是在生产实践中会严重降低大豆出苗率,同时影响产量和加工品质。采用混合群体分离测序(bulked segregant analysis sequencing,BSA-Seq)解析大豆种子硬实性状的遗传基础及候选基因,为大豆硬实的分子机理研究提供理论依据。【方法】经甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)诱变大豆中品661种子获得硬实突变体M_(zp661),将其与栽培大豆中黄13(父本)杂交构建重组自交系(recombinant inbred line,RIL)群体,对不同株系的种子进行硬实性、吸水率和种皮解剖结构鉴定。选取RIL群体中硬实型和正常吸胀型2种极端材料分别构建混池,利用BSA-Seq技术检测不同极端材料及亲本基因型,结合欧式距离(euclidean distance,ED)和delta SNP-index、delta InDel-index关联分析方法,开展大豆种子硬实遗传位点的挖掘,进一步利用生物信息学分析、大豆不同组织的转录组数据和基因注释信息挖掘显著关联区域的候选基因。【结果】突变体M_(zp661)后代中,吸胀型种子各部位均具有吸水能力,种子体积随浸水时间延长不断增大,然而,硬实型种子浸水36 h内体积未发生变化,随着浸水时间的持续延长,种皮开始局部出现皱缩,并逐渐向其他部位扩散,子叶恢复吸胀能力。硬实型种子种皮表面光滑且结构紧密、角质层呈规则的网状结构、栅栏层较厚,而吸胀型种子表皮有气孔且结构松散、角质层有微小的裂缝、栅栏层较薄,表明突变体M_(zp661)种子硬实与种皮不透水/气相关;ED和delta SNP-index、delta InDel-index关联分析方法不仅鉴定到已报道种子物理休眠遗传位点qHS1,而且检测到1个一致性关联区域Chr.06:45897227—47746047,该区间共含有189个基因,转录组数据及基因注释挖掘到种子中特异高表达的Glyma.06G275300可能为该关联区域调控大豆种子硬实的关键候选基因。【结论】大豆突变体M_(zp661)种子硬实由种皮不透水/气所致,利用BSA-Seq法鉴定到Glyma.06G275300可能为影响种皮结构的候选基因。

作物抗病基因工程研究进展

控制植物病害的关键,取决于对植物与病原菌相互作用的分子机理的了解。将抗病基因、信号传导/调控基因、抗菌蛋白基因等导入拟改良的作物、选育抗病新品系,是当前作物抗病基因工程研究的主要策略。本文介绍利用植物抗病反应中系列重要基因进行作物抗病基因工程的研究进展,讨论了目前作物抗病基因工程中存在的问题及其解决的方法。

水稻抗稻瘟病基因资源与分子育种策略

稻瘟病是水稻主要病害之一,利用抗病品种是防治稻瘟病最经济、有效和安全的措施。近年来,随着植物先天免疫机制、抗病分子生物学以及水稻和稻瘟菌基因组学研究的不断深入,一系列参与病原菌识别和防卫信号传导与应答,以及外源抗菌蛋白、病原菌激发子等抗病相关基因陆续被鉴定和克隆,为提高水稻抗稻瘟病能力提供了一些新的基因资源、育种策略和技术。本文概述了国内外近年来克隆的主要抗稻瘟病基因资源及其在分子育种研究中应用的进展,提出了通过转基因手段整合不同防卫反应关键调控基因的抗稻瘟病聚合育种策略。

防御素的生物学特性及其抗病基因工程

防御素是一种富含半胱氨酸的小分子多肽,对细菌等微生物具有广谱抗性,且作用机制特殊。迄今为止,国内外在防御素方面进行了大量的研究,已经从各类生物体中分离出不同种类的防御素,并在基因工程和医药领域呈现广泛的应用前景。文章对防御素的分类、生物学特性,包括哺乳动物α-、β-、θ-防御素、昆虫以及植物防御素的分子结构及抗菌活性进行了综述,阐述了防御素的膜作用及与细胞内复合物结合的作用机制。总结和归纳了防御素基因的分离、表达研究进展及动、植物防御素基因在抗病基因工程领域的应用,并对防御素在未来的生物制药和植物抗病基因工程方面的应用前景进行了展望。

小麦抗病基因工程的研究进展

小麦是世界上重要的粮食作物,但是各种病害严重威胁着小麦的产量和品质。分子生物学和植物分子病理学的发展与应用推进了植物抗病基因工程的发展。抗病基因工程与传统育种方法有机结合,是培育小麦高产、稳产、优质新品种的有效途径。本文从植物抗病反应网络上不同基因的作用方式与利用情况等角度,如抗病基因、防卫基因、信号传导基因、病程相关蛋白基因和病毒依赖性修饰基因等方面,介绍了小麦抗病基因工程的研究进展,并指出存在的问题及可能的解决策略。

大豆DMP基因的生物信息学及基因多样性分析

双单倍体技术被广泛应用于加速植物育种,近年来,利用含有功能未知结构域DUF679膜蛋白(DMP)突变的玉米(Zea mays L.)株系作为单倍体诱导株系。本研究搜索与玉米DMP基因氨基酸序列同源率60%以上的大豆DMP基因,对其进行生物信息学分析;并结合2214份重测序数据库探究GmDMP基因在大豆中的分子机理及生物多样性。分析结果表明:GmDMP1(Glyma.18G097400)与GmDMP2(Glyma.18G098300),与玉米DMP基因的进化关系亲缘度极高,基因全长均为645 bp,氨基酸序列同源率高达95%以上,编码氨基酸数目与等电点完全一致,磷酸化分布仅有1个位点差异。GmDMP1与GmDMP2基因均有1个相同的结构域DUF679,定位于内质网的可能性较大,均为跨膜的不分泌亲水蛋白。GmDMP1与GmDMP2基因在2214份种质资源中分别发生了3个与1个非同义突变,各组成3种和2种单倍型。GmDMP1H3在驯化中受到了强烈的选择,GmDMP1H1与GmDMP1H2单倍型的突变位点在结构域DUF679上。将大豆的两个DMP基因突变后可能获得单倍体诱导系,从而缩短大豆育种年限。

引自美国的大豆资源抗疫霉根腐病基因分析

大豆疫霉根腐病是影响中国大豆生产的主要病害之一,利用抗病品种是防治该病最经济有效的方法。本研究通过下胚轴创伤接种鉴定了13个大豆疫霉菌株在从美国引进的85个大豆品种(系)上的反应,结果表明,72个品种(系)抗1～12个大豆疫霉菌株。通过与14个含有单个已知抗疫霉根腐病基因的大豆品种(系)的反应型比较并结合系谱分析,明确35个品种(系)分别含有Rps1a、Rps1c、Rps1k、Rps2、Rps3c、Rps4、Rps5、Rps6和Rps7抗病基因或基因组合,其中有14个品种(系)含有Rps1a,1个含有Rps1c,2个含有Rps1k。这3个基因能够有效抵御我国大豆疫霉种群,可以直接用于抗病育种。

小麦转录因子基因TaPHR1参与调控每穗小穗数

利用水分高效基因资源创制新型小麦品种是应对气候变化和人口高速增长的有效途径。MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)是植物中最大的转录因子家族之一,参与调控植物生长发育,生物和非生物胁迫。本研究在TaPHR1-4A和TaPHR1-4B中分别鉴定出19个和15个SNP,基于这些多态性位点开发了分子标记。关联分析表明,Hap-4B-I是小穗数多的优异单倍型。通过创制两个回交导入系群体,进一步证实Hap-4B-I有利于改善小麦穗部性状。TaPHR1的转录表达分析发现Hap-4B-I单倍型幼穗中TaPHR1的表达水平均高于Hap-4B-II单倍型。此外,TaPHR1在水稻中的异源表达导致穗分支变多,也证实TaPHR1参与调控每穗小穗数。小麦育成品种的时空分布分析发现尽管Hap-4B-II在我国现代育成品种中占比最多,但随小麦育种时间的推进,Hap-4B-I的占比在逐渐增多。总之,TaPHR1是小麦每穗小穗数的正调节因子。因此,本研究开发的分子标记可作为小麦标记辅助选择和遗传改良的重要来源。

水稻白叶枯病感病相关基因Xig1的分子鉴定及抗病资源创制

水稻白叶枯病相关基因Xig1在感病亲本IR24中受白叶枯病菌的诱导表达。本研究通过克隆与比较Xig1的序列后发现,抗病野生稻导入系W6023与感病亲本IR24中Xig1等位基因的差异主要集中在启动子区。水稻原生质体观察XIG1在细胞中的定位,显示XIG1定位于细胞质中。利用CRISPR/Cas9系统对感病籼稻品种IR24的Xig1靶点进行基因组编辑,获得并评价了多个Xig1定点突变株系对白叶枯菌的抗性。与野生型相比,8个IR24的Xig1基因定点突变株系对水稻白叶枯病的抗性得到明显提高,而农艺性状无显著差异。Xig1是新发现的水稻白叶枯病感病基因,该基因在水稻白叶枯病感病性中贡献的研究,不仅为创制新的抗病资源提供理论指导,还将丰富和加深我们对植物先天免疫系统的认知。

中国小麦品种对白粉病的抗性反应与抗病基因检测

利用来自不同生态区的8个白粉菌菌株对20世纪80年代以来国家审定(认定)品种、近期参加国家区域试验的品系和核心种质等小麦材料进行抗病性评价,同时利用与Pm4a、Pm8和Pm21基因连锁的分子标记检测了相关抗病基因的存在。在148个国家审定品种中有16.9%的品种能够抗多个菌株,其中大多是近10年选育的品种。不同年代审定的品种中感病品种的频率均超过50%。各个小麦生产区抗病品种的频率高低与该地区白粉病的严重性和育种的关注程度有一定关系。在1160份小麦核心种质中抗E09菌株的地方品种和育成品种的比例只有3.4%和4.2%。西南冬麦区和新疆冬麦区入选的品种抗病频率较高,华南冬麦区、东北春麦区和北方春麦区没有发现抗E09菌株的品种。多菌株鉴定结果表明,263份微核心种质中33.7%的品种表现抗病性,其中大多数品种能够抗1～2个菌株,因此在核心种质的利用中应注意选用抗性强的品种作为轮回亲本,同时有必要构建抗白粉病的应用核心种质,以提高核心种质的利用效果。根据抗病基因分子标记检测结果,我国小麦品种有43.2%含有Pm8基因,该基因在区域试验参试品种中的频率也很高,特别是在黄淮麦区培育的品种中频率仍高达50%;Pm4a和Pm21基因主要出现在长江流域培育的品种中。有些抗性突出的品种可能含有其他抗病基因。

分子标记辅助培育水稻抗白叶枯病和稻瘟病三基因聚合系

水稻的白叶枯病和稻瘟病是水稻的两大主要病害，通过分子标记辅助选择与传统的杂交、自交相结合的方法，将抗稻瘟病的Pi9（t）基因和抗白叶枯病的Xa21及Xa23基因聚合到同一株系中，经多代大田或／和温室接菌鉴定、室内标记选择和田间农艺性状的筛选，获得了4个三基因聚合且农艺性状优良的株系L17-L20。用不同国家和地区的20个稻瘟病小种、中国流行的7个白叶枯病菌系c1-c7以及安徽省流行的白叶枯病菌系进行大田或，和温室抗病性鉴定，结果显示，株系L17-L20对20个稻瘟病小种均表现出抗性，抗性水平与Pi9（t）基因的供体亲本75-1-127相当，抗谱相同；对白叶枯病的抗性和抗谱与Xa23基因相似，不论在苗期还是在成株期均抗白叶枯病。与Xa21、Xa23基因的供体亲本M12和CBB23相比，成株期的抗性水平有所增强。利用多重PCR技术，在同一PCR反应中可同时选择Pig（t）和Xa21基因，提高了PCR选择效率。

稻瘟病抗性基因Pita和Pib在我国水稻主栽品种中的分布

主效抗稻瘟病基因Pita和Pib在我国很多稻区表现高水平的稻瘟病抗性,被广泛应用于我国的水稻育种和生产。但这2个基因在国内主栽品种中的分布及利用情况一直缺乏详细的资料,致使育种利用上存在着盲目性。本研究利用源于Pita和Pib基因本身的特异性分子标记,结合稻瘟病菌接种鉴定,检测和分析了我国58份水稻主栽品种(杂交稻亲本)的Pita和Pib抗性基因型。结果表明,特籼占25、佳禾早占、密阳46、测64-7等4个籼稻品种携带Pita和Pib2个基因;籼小占等4个籼稻品种(系)和早丰9号等5个粳稻品种携带抗性基因Pita;绵恢501等5个籼稻品种(系)和粳稻品种武育粳7号、辽粳454携带抗性基因Pib。

水稻抗白叶枯病新基因Xa32(t)的鉴定和初步定位

通过多菌系接种鉴定及抗谱分析,并与目前国际上已知抗白叶枯病基因比较,证明在水稻抗源C4064中含有一个新的抗白叶枯病基因,暂命名为Xa32(t)。应用分离集团分析法(BSA),借助SSR和EST等分子标记,对该基因进行了分子标记定位。通过对F2分离群体及F3家系单株进行遗传连锁性检测,发现6个位于水稻第11染色体长臂末端的分子标记RM27256、RM27274、RM2064、ZCK24、RM6293和RM5926与Xa32(t)基因连锁。它们与Xa32(t)基因间的遗传距离分别为2.1、1.0、1.0、0.5、1.5和2.6cM。其中标记RM6293和RM5926位于染色体近端粒一侧,其他4个标记RM27256、RM27274、RM2064和ZCK24位于基因的另一侧。将Xa32(t)定位在水稻第11染色体长臂末端2.0cM范围内。

植物组织培养再生相关基因鉴定、克隆和应用研究进展

离体植物组织体细胞胚胎发生是一个复杂的无性繁殖过程,依次经历外源植物激素信号应答、已分化细胞的脱分化、静止细胞的再分裂以及特定组织、器官原基或分生组织的形成等,是多个基因在外界因素刺激下协调、有序表达和互作的结果,不但受培养基中植物激素和营养成分的影响,也与外植体的生理状态关系密切。本文综述了外源激素和内源激素在植物组织培养中的作用,以及外源激素对内源激素的调节功能;重点介绍了5类与植物体细胞胚胎发生有关的候选基因,包括体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶、阿拉伯葡聚糖酶、亚硝酸还原酶、生长素结合蛋白和抗氧化酶。再生相关基因的利用不但有助于提高植物组织培养植株再生率和遗传转化率,而且有助于获得安全型转基因植物,在基因工程育种中具有潜在应用前景。不同植物和同种植物不同外植体组织培养中调控体细胞胚胎发生的主效基因可能不同,关键再生相关基因的克隆和功能鉴定是今后需要加强的方向。

转PvP5CS1基因拟南芥植株对干旱和盐胁迫的反应

为探索普通菜豆脯氨酸合成酶基因P5CS1在植物渗透胁迫中的作用,本研究应用农杆菌介导法,将PvP5CS1基因转入拟南芥,获得6株阳性转基因株系;通过检测转基因植株与野生型植株在干旱和盐胁迫下种子发芽率,幼苗脯氨酸含量、株系电导率、相对根长和成株死亡率,分析了PvP5CS1基因的表达对改善拟南芥抗渗透胁迫的效应。结果表明,在150mmolL-1NaCl和150mmolL-1甘露醇渗透胁迫下,转基因植株平均相对发芽率分别是野生型的1.60倍和1.62倍;150、250mmolL-1甘露醇和150mmolL-1NaCl处理下,转基因拟南芥植株平均脯氨酸含量分别是野生型的2.68、1.30和1.30倍;平均相对电导率分别是野生型植株的85%、77%和85%;平均相对根长分别是野生型植株的1.2、1.3和1.2倍;300mmolL-1NaCl处理下,转基因植株的平均死亡率为42%,显著低于野生型(90%)(P<0.05);干旱胁迫下,转基因植株的平均死亡率为56%,显著低于野生型(70%)(P<0.05),说明PvP5CS1基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的抗旱性和耐盐性。

数量性状基因定位研究中若干常见问题的分析与解答

QTL作图是基因精细定位、克隆以及有效开展分子育种的基础,在利用QTL作图开展数量性状基因定位研究的过程中经常会碰到一些问题,与统计方法有关的一些问题包括LOD的统计学意义是什么?检测QTL的可信度和LOD临界值的关系是什么?如何评价不同的QTL作图方法?提高QTL检测效率的途径有哪些?与遗传参数估计有关的一些问题包括QTL的贡献率是如何计算出来的?如何确定QTL有利等位基因的来源?选择基因型分析的有效性如何?复合性状是否适宜于QTL作图?与作图群体及遗传图谱有关的一些问题包括QTL作图群体中表型数据是否要求服从正态分布?加密标记是否可以显著提高QTL检测功效?缺失分子标记对QTL作图有什么影响?奇异分离标记对QTL作图有什么影响?文章试图结合笔者多年研究工作对这12个有共性的常见问题做出分析和解答,以供科研工作者参考。

植物基因启动子的克隆及其功能研究进展

启动子在植物基因表达调控过程中起着重要作用。对于植物基因启动子的克隆及其功能研究有助于了解信号传递途径和基因表达调控模式,为植物转基因工程研究提供理论依据。本文综述了植物基因启动子的基本结构、类型、克隆方法及功能研究进展,着重介绍了广泛应用于转基因工程的诱导型启动子及启动子功能分析,展望了今后植物启动子的研究方向。

分子标记辅助选择Xa23基因培育杂交稻抗白叶枯病恢复系

水稻抗白叶枯病新基因Xa23抗谱广、抗性强,被定位在第11染色体上。以携带抗白叶枯病基因Xa23的抗病品系CBB23为抗源,以优良杂交稻亲本9311和1826为受体材料,采用杂交和复交,在分离群体中利用与Xa23紧密连锁的EST标记C189进行分子标记辅助选择,通过苗期分子标记检测和成株期农艺性状选择,获得160份目标基因纯合且农艺性状稳定的株系。使用鉴别菌系P6,采用人工剪叶接种法,在苗期和孕穗期对21份重点株系进行了抗性鉴定,所有株系在苗期和孕穗期都表现抗病。同时对3个不育系与其中5个株系配制的15个杂交组合进行了抗性鉴定,所有组合在苗期表现抗或中抗,在孕穗期表现抗。对其中6个杂交组合进行了品比试验,2个组合产量略低于对照两优培九,其余4个组合的产量均高于两优培九,用于测配的3个株系C6201、C6271和C6351有望作为杂交稻恢复系在生产中应用。研究表明在育种进程中利用与Xa23基因紧密连锁的分子标记C189开展抗白叶枯病分子标记辅助育种是一种有效的途径。