广西柑橘黄龙病植株韧皮部内生细菌多样性分析

【目的】对柑橘健康植株和感染黄龙病植株的韧皮部内生细菌的多样性进行比较分析,为研究柑橘植株韧皮部内生细菌与黄龙病菌之间的相互关系奠定基础。【方法】采用常规分离培养与分子鉴定的方法和基于16S rDNA基因的限制性酶切长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析的方法。【结果】用常规分离与分子鉴定方法获得10个属细菌类群,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)为无症健株的优势菌群;微杆菌属(Microbacterium sp.)、芽孢杆菌属、假单胞菌属和考克氏菌属.为黄龙病罹病植株的优势菌群。PCR-RFLP方法得到29种酶切图谱,共鉴定出10属可培养细菌以及11种不可培养细菌。健株与病株中Dyella sp.、Pseudomonas sp.、Serratia sp.和未培养细菌所占比例均大于5%。柑橘健株与病株中细菌的种群密度和菌群种类存在明显差异。【结论】研究结果表明柑橘健株和病株韧皮部组织中的内生细菌优势菌群存在明显差异,而伴生细菌的优势菌群与黄龙病菌的相互关系正在深入分析研究。

基于16S rDNA序列的柑桔木虱体内共生菌多样性研究

昆虫消化道内是一个复杂的微生态系统,有大量的微生物存在。这些微生物对寄主发育、营养吸收和防御方面都起着重要的作用。本文利用基于16S rRNA基因的PCR-RFLP指纹图谱法和变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)的方法对柑桔黄龙病虫-媒柑桔木虱Diaphorina citri体内细菌菌群多样性进行了研究。经PCR-RFLP分析显示31条序列与变形菌门的假单胞菌科、肠杆菌科、黄单胞菌科、伯克氏菌科、立克次氏菌科和根瘤菌科细菌具有较高同源性。柑桔木虱内共生细菌的优势菌群依次为合胞体共生菌(syncytium endosymbiont)(同源性99%,5条序列,分离频率31%)、Candidatus Carsonella ruddii和Mycetocyte内共生菌(同源性98%,5条序列,分离频率31%)以及亚洲韧皮杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)和内共生菌Wolbachia。对柑桔木虱内生细菌16S rDNA V3区序列的PCR-DGGE分析,条带相似性的UPMAGA聚类分析表明,采自九里香Murraya paniculata的柑桔木虱内生细菌大多聚为一支,而来自柑桔的聚在另一支,说明寄主差异对柑桔木虱内生细菌菌群构成的影响大于地理位置的影响。将PCR-DGGE条带测序,序列经GenBank序列比对发现柑桔木虱内生细菌主要属于变形菌门假单胞菌科、立克次氏菌科、肠杆菌科、黄单胞菌科以及厚壁菌门链球菌科和芽孢杆菌科。合胞体共生菌(条带3-4)因其稳定存在于木虱体内且不随柑桔木虱寄主和地理位置的改变而变化,可能是柑桔木虱体内的优势共生菌;内共生细菌Wolbachia也在柑桔木虱内稳定存在,表明我国柑桔木虱感染Wolbachia是普遍现象。PCR-RFLP和PCR-DGGE两种方法相结合较好地反映了柑桔木虱内生细菌菌群的多样性,而且均显示出柑桔木虱内的合胞体共生菌是主要的优势菌群。

中国部分地区柑桔木虱体内感染Wolbachia的检测及其系统发育分析

Wolbachia是一种广泛分布于节肢动物体内的共生细菌,该共生菌经寄主卵的细胞质传播并参与多种寄主生殖活动调控,对节肢动物的物种进化有着重要意义并可能应用于害虫的生物防治。本研究以柑桔黄龙病(Huanglongbing,HLB)的主要传播媒介——柑桔木虱Diaphorina citri为研究对象,通过Wolbachia的16S rDNA、细胞分裂基因(ftsZ)、表面蛋白基因(wsp)的特异引物对来自于中国广西北海、广西柳州、广东深圳、广东阳春、福建福州5个地区的柑桔木虱进行PCR扩增,并对扩增产物进行克隆测序,与GenBank中相关序列进行比对分析,建立了柑桔木虱共生Wolbachia的系统发育树。结果显示上述5个地区的柑桔木虱均存在Wolbachia感染,通过Wolbachia的16S rDNA,ftsZ基因和wsp基因DNA序列的系统发育分析表明,5个地区的柑桔木虱体内的Wolbachia均属于B组;基于wsp基因的系统发育分析进一步表明5个地区的亚洲柑桔木虱体内的Wolbachia属于B组的Con亚组,且不同地区柑桔木虱体内的Wolbachia的16S rDNA,ftsZ基因和wsp基因序列差异不明显。研究结果为认识柑桔黄龙病传播媒介昆虫的进化及其综合防治提供了重要的参考依据。

防治果园周边柑橘木虱控制黄龙病效果研究

在新种柑橘园中栽种柑橘无毒苗,定期监测和防治果园内柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama,防治时期为各新梢萌芽期,重点防治期为早夏梢期和早秋梢期;与此同时,调查柑橘园周围柑橘木虱寄主植物,每年2月下旬、5月上旬、8月下旬和11月下旬定期喷药,清除柑橘园周围寄主植物上的柑橘木虱。结果表明,果园内柑橘木虱和黄龙病均得到有效的控制,果园内柑橘木虱种群数量控制在很低的水平,最高为2.25头/公顷,最低为0;黄龙病发病率也很低,2008年为8‰,实施该技术后,发病率逐年下降,2012年降低到0.1‰。

有机柑橘种植中五种溃疡病防治药剂作用评价

通过田间药效试验筛选防治柑橘溃疡病(Xanthomonas axonopodis pv.citri)的有效有机药剂,以清水为对照,工农-16型背负手摇喷雾器喷雾,以咪鲜.松、代森铵和叶青双作比较,对比研究了硫酸铜钙、噻菌铜、四霉素、春雷霉素与王铜混配剂、水胆矾和两水硫酸钙结合体等5种杀菌剂对柑橘溃疡病的防治效果。结果表明,硫酸铜钙、噻菌铜防治效果较好,与咪鲜.松相当,四霉素、春雷霉素与王铜混配剂(加瑞农)、水胆矾和二水硫酸钙结合体防治效果较差,低于代森铵和叶青双;首次对上述药剂的抗雨水能力进行了评价,结果表明,加瑞农、咪鲜.松抗雨水能力最强,其次是硫酸铜钙、水胆矾和两水硫酸钙结合体,噻菌铜、四霉素效果较差,代森铵、叶青双最差。试验中各处理均无药害产生。

柑橘黄龙病侵染相关抗病基因同源序列的克隆鉴定与表达分析

[目的]从黄龙病耐病寄主植物cDNA中筛选抗病基因相关序列并对其进行表达分析研究。[方法]根据已克隆的植物抗性基因表达产物NBS-LRR保守区域设计简并引物,以耐HLB的柑橘属柚cDNA为模板扩增RGAs,并进行实时荧光定量PCR。[结果]通过RFLP分析及克隆测序共得到5个NBS类抗病基因相似序列(RGAs)片段,在GenBank上登录号为HM777043～HM777047。通过Clustalx、DNAMAN等软件分析5个RGAs及其推导的氨基酸的相似性,结果显示它们均含有典型NBS-LRR类抗性基因所具有的保守区域:P-loop、Kinase-2a、GL-PLAL,其与已克隆的烟草N、亚麻L6、拟南芥RPS2、RPS5、RPP8、RPM1等抗病基因在保守区域氨基酸水平上的相似性为19.71%～42.86%。根据得到的序列设计特异性引物,对5个RGAs在HLB侵染过程中的表达进行定量PCR,结果显示嫁接病芽接穗后的8次连续采样中5个RGA的表达受到不同程度的调控。[结论]表明5个RGAs可能与黄龙病的侵染有关。

亚洲韧皮杆菌兼性厌氧型伴生细菌鉴定及优势菌群分析

以定向分离培养和基于16S rDNA的PCR-DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)方法,分析感黄龙病柑橘与健康柑橘植株不同部位的内生细菌多样性,分离柑橘组织共获得19株可培养的兼性厌氧型内生细菌,经形态、生理生化结合16S rDNA分子方法鉴定其隶属于12个属,其中短小杆菌属Curtobacterium sp.(IF:29.07%)、芽孢杆菌属Bacillus sp.(IF:23.12%)和微杆菌属Microbacterium sp.(IF:21.09%)为罹病植株的优势菌群,芽孢杆菌属Bacillus sp.(IF:21.03%)、动性球菌属Planococcus sp.(IF:20.69%)和假单胞菌属Pseudomonas sp.(IF:17.44%)为无症健株的优势菌群。对DGGE方法得到的50条16S rDNA目标条带进行序列比对,共鉴定出9个属的细菌,结果表明沙雷氏菌属Serrations sp.(IF:28%)是优势菌属,泛菌属Pantoea sp.(IF:14%)是次优势菌属;病果桔络中黄龙病菌含量最高(>1%),而罹病植株其他部位的黄龙病菌丰度较低。PCR-DGGE图谱也显示感病和健康柑橘组织的内生细菌存在差异。

柑橘黄龙病兼性厌氧型伴生细菌的分离及优势菌群分析

柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害,主要由难人工培养的韧皮杆菌所引起（Candidatus Liberibacter asiaticus）[1]。近年的研究结果表明黄龙病发病组织内除了韧皮杆菌外,