牛去透明带卵体细胞核移植技术的应用研究

本研究通过进一步完善和简化"去透明带双半卵体细胞克隆牛技术",探讨了生产应用的可能性。结果表明:(1)在卵母细胞体外成熟发育的特定阶段(17～20h间)采用分期分批显微盲吸法去核,去核率可高达95%以上;(2)一次同时将2枚去核后的半卵和1枚供核体细胞粘合在一起,可大大提高电击融合效率;(3)克隆重构胚在DMAP中激活时间从4h延长至16h仍有较高的卵裂率和囊胚率;(4)利用OPS法玻璃化冷冻保存牛体细胞克隆胚胎,解冻后胚胎可用率极显著地高于常规慢速冷冻法;(5)利用改进后的体细胞核移植程序工厂化批量生产牛体细胞克隆胚胎,获得88.2%(2575/2920)卵裂率、41.6%(1215/2920)囊胚率、75.4%(916/1215)冻胚率,冷冻胚胎移植后30d妊娠率为28.1%(48/171)。结果说明,本研究的牛去透明带双半卵体细胞核移植技术已可达到克隆胚胎批量生产应用的水平。

牛体细胞核移植胚胎的批量化生产

利用2枚显微去核后的半卵与1枚供体细胞同步融合,并结合微穴法(WOWs)培养体系批量化生产成年牛克隆胚胎(日产40～80枚).结果,重构胚电融合率95.7%(3059/3197)、卵裂率87.1%(2637/3027)、囊胚率41.1%(1244/3027)和可冻胚率(72.5%,933/1244)均达到较高水平.克隆胚胎采用玻璃微管玻璃化冷冻保存数月后移植,30日龄时妊娠率为28.1%(48/171),已经产下5头足月克隆牛续.结果表明,该方法具有产业开发潜力.