产黄曲霉毒素真菌双重荧光定量PCR检测技术的建立与应用

为实现产黄曲霉毒素真菌的快速检测,本研究建立了检测产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因的双重荧光定量PCR方法。分别针对aflR基因和nor-l基因保守序列,各设计2对特异性引物和探针,通过引物对间的有效性实验各筛选出1对最优的aflR引物探针和nor-1引物探针,随后建立并优化双重荧光定量PCR的反应条件,构建标准曲线,测定该方法的重复性、灵敏度和特异性。结果显示,成功筛选出aflR-2和nor1-2 2组引物/探针组合,并优化和确定了引物/探针的最佳反应终浓度。特异性实验结果显示,本研究建立的检测方法仅对产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因呈现特异性扩增,对黑曲霉、碳黑曲霉、赭曲霉和镰刀菌等常见产毒真菌的核酸样品均无扩增曲线。建立的方法重复性好,批内和批间变异系数均<3%,双重反应体系的检测灵敏度均低至1×10^(2)copies/μL。利用本研究所建立的方法与ELISA试剂盒分别对80份食品样品进行检测,结果显示,双重荧光定量PCR共检测出9份阳性样品,而ELISA试剂盒只检测出了7份阳性,表明本研究建立的方法具有更高的灵敏度和准确性。

猪星状病毒(PAstV)在中国流行的研究进展

猪星状病毒(Porcine astrovirus,PAstV)是一种无包膜的、单股正链RNA病毒,存在5种基因型,是一种常见的猪肠道传染病病毒。PAstV广泛流行于我国猪群中,常与其他猪肠道病原混合感染而引起腹泻,给我国养猪业带来了严重的经济损失。本文综述了PAstV在我国2006年~2021年间猪群中的流行情况,系统分析了PAstV在不同年份的阳性率、各省份地区分布情况、与不同猪肠道病原的混合感染情况以及不同基因型的流行特点,为掌握我国PAstV流行情况以及病毒防控提供重要参考。

动物肠缺氧模型研究进展

肠缺氧是肠组织氧气需求量高于供应量的病理现象,是多种肠道疾病的直接诱发因素、预警信号和关键特征之一。建立真实可靠的肠缺氧状态动物模型或者能模拟肠缺氧的细胞模型,对肠缺氧相关疾病的病理机制研究至关重要。本文综述了近年来适用于构建肠缺氧模型的方法,重点围绕循环性、化学性和环境性肠缺氧动物模型,物理法和化学法诱导的离体肠细胞缺氧模型和离体肠道类器官缺氧模型的构建策略、模型优劣及应用场景进行分析,为动物肠缺氧疾病的发病机制研究及治疗药物的发掘和临床药效学评价提供参考。

单增李斯特菌感染并调控宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)的研究

为探究单增李斯特菌感染与宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)表达的相互影响机制,本研究将单增李斯特菌野生株(LM-EGD-e)以MOI 200感染HeLa细胞5 h后,利用qRT-PCR检测感染LM-EGD-e后HeLa细胞中Pcca基因的转录水平变化,结果显示LM-EGD-e感染HeLa细胞中Pcca基因的转录水平无明显变化(log2FC=-0.305);采用相应试剂盒分别提取感染后的HeLa细胞蛋白和线粒体蛋白,采用western blot检测PCCA蛋白表达变化,结果显示,LM-EGD-e感染后的HeLa细胞中,以及线粒体中PCCA蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。PCR扩增Pcca基因后构建pCMV-N-HA-PCCA重组质粒,并经PCR和测序鉴定正确后转染HeLa细胞中过表达PCCA蛋白后,利用qRT-PCR检测HeLa细胞中Pcca基因的转录水平,收集细胞总蛋白采用western blot检测PCCA蛋白表达水平,结果显示,与转染空载体的细胞相比,转染重组质粒的HeLa细胞中Pcca基因的转录水平上调(log2FC=8.454),且细胞内PCCA蛋白表达量显著增加(P<0.001)。利用LM-EGD-e以MOI 200感染过表达PCCA蛋白的HeLa细胞,在感染后2 h、5 h和8 h分别收集感染细胞进行点样计数,结果显示,感染后各时间点PCCA蛋白过表达显著或极显著抑制LM-EGD-e的感染及其在胞内增殖的能力(P<0.05、P<0.001、P<0.001)。综上所述,单增李斯特菌感染对宿主细胞内PCCA蛋白的表达无显著影响,但在宿主细胞中过表达PCCA会降低单增李斯特菌的胞内增殖能力。本研究首次探究了单增李斯特菌与宿主PCCA蛋白的调控关系,为深入探究单增李斯特菌等重要胞内菌的感染与宿主的内在联系机制,以及防控该病原感染奠定了基础。

单增李斯特菌谷氧还蛋白调控氧化应激相关基因转录的研究

本实验室前期对单增李斯特菌(LM)谷氧还蛋白(Grx)转录组数据进行了分析,在此基础上为了对Grx调控细胞色素氧化酶等应激相关基因(lmo0722、qox A、qox B、gr)的转录及其作用机制研究,本研究将Δgrx与野生株EGD-e经4 mmol/L肼应激后,分别提取总RNA并反转录为cDNA作为模板,利用RT-q PCR检测Grx调控细胞色素氧化酶等应激相关基因转录情况,结果显示,Δgrx与野生株EGD-e相比,grx基因缺失引起qox B、qox A、gr、lmo0722等基因的转录水平显著上调(分别上调30、29、17和5.6倍)。利用李斯特菌穿梭质粒构建携带调控基因启动子序列的gfp报告质粒,电转化至野生株EGD-e和缺失株Δgrx感受态细胞中,获得含GFP的重组报告菌株。将这两种含GFP的重组报告菌液分别加入4 mmol/L肼后检测荧光强度,结果显示,EGD-e携带的GFP荧光数值显著低于缺失株Δgrx(P<0.01),进一步表明Grx参与调控上述应激相关基因的转录。将扩增的lmo0722、qox A、qox B和gr基因的启动子和Grx、Prf A和GAPDH重组蛋白混合,37℃孵育60 min后进行凝胶迁移试验(EMSA),结果显示,Grx和上述调控基因启动子不直接结合,提示Grx可能通过间接方式参与该调控过程。本研究首次证实LM Grx通过对氧化应激相关基因的转录调控进而在细菌抗氧化应激环境适应过程中发挥重要作用,为系统阐述重要食源性病原菌在环境适应中发挥作用的调控机制提供了科学参考。

华南虎子宫内膜炎摩氏摩根菌分离鉴定及生物学特性研究

【目的】对杭州野生动物世界1例成年雌性华南虎(Panthera tigris amoyensis)子宫内膜炎病例的病原进行分离鉴定及生物学特性研究。【方法】无菌采集患虎子宫分泌物进行细菌分离培养、形态观察、梅里埃Vitek 2 COMPACT系统的生化鉴定以及16S rDNA序列分析,采用小鼠腹腔接种模型检测临床分离株致病性,并通过药敏纸片扩散法K-B鉴定该菌对50种药物的敏感性,采用筛选的敏感药物联合对症治疗,持续观察疾病是否复发及其产仔情况。【结果】从患虎子宫分泌物中获得1株革兰阴性短棒状杆菌;梅里埃Vitek 2 COMPACT系统革兰阴性卡鉴定结果显示,该临床分离株为摩氏摩根菌,菌株可发酵葡萄糖,分解甘露糖、D-葡萄糖,且尿素酶、磷酸酶、鸟氨酸脱羧酶、γ-谷氨酰转移酶反应呈阳性;序列比对分析发现,16S rDNA序列与摩氏摩根菌的相似性最高,达99%以上,进一步表明该菌为摩氏摩根菌,并命名为HNH2019;药敏结果显示,该菌多重耐药,对多黏菌素B、丁胺卡那、复方新诺明、麦迪霉素、四环素、头孢哌酮等33种药物呈不同程度的耐药,对头孢噻肟、头孢曲松和头孢西丁等6种药物中度敏感,对妥布霉素、洛美沙星、依诺沙星和氟苯尼考等11种药物敏感;小鼠致病性分析结果显示,该分离株腹腔接种ICR小鼠的半数致死量为1×107.5 CFU;采用敏感药物治疗后,该虎痊愈且连续3年未复发,截至2022年9月,该母虎已经多次怀孕并合计生产了5仔。【结论】本研究分离鉴定到1株华南虎源多重耐药致病性摩氏摩根菌,经筛选的敏感药物治疗,该虎子宫内膜炎痊愈未复发,研究结果为同类疫病防治提供了病例参考和数据支持,提示应重视摩氏摩根菌对动物的潜在危害。

两种启动子拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒ZJ-JX-2015株效率的比较研究

为比较不同启动子驱动的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强毒株ZJ-JX-2015感染性克隆拯救的各重组病毒的效率,本研究将ZJ-JX-2015株全基因组引入无义突变位点(C-G,形成Bst B I酶切位点)作为后期鉴定标签并分成4段经PCR扩增后,分别克隆至含CMV启动子的p SMART-BAC载体和含T7启动子的p WSK-29载体中构建感染性克隆质粒p SMART-BAC-CMV-r PRRSV和p WSK-29-T7-r PRRSV,经PCR及测序鉴定正确后将前者分别转染BHK-21和293T细胞;将后者转染BHK-21(T7)细胞。48 h后收集上述各细胞上清液接种Marc-145细胞并连续传10代。通过观察细胞病变(CPE),收集不同代次Marc-145细胞上清液经PCR及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定拯救的各重组病毒。将拯救的各重组病毒以MOI 0.1接种Marc-145细胞,通过测定不同时间各病毒上清液的病毒效价(TCID50)绘制生长曲线。结果显示,各细胞上清液[BHK-21、293T细胞及BHK-21细胞(T7)]在Marc-145细胞中传至第2代时均出现CPE;PCR及测序鉴定结果显示,各代次的各组Marc-145细胞上清液均能扩增到544 bp的目的片段,且均含遗传标记Bst B I酶切位点。IFA结果显示,上述各代次各组Marc-145细胞上清液接种的各细胞中均出现绿色荧光,对照Marc-145细胞无绿色荧光。上述结果表明,拯救了3株重组PRRSV:BHK-r JX15、293T-r JX15(分别转染BHK21及293T细胞所得)及T7-r JX15株[转染BHK-21(T7)细胞所得],且各病毒的遗传稳定性较强。测定各病毒TCID50并绘制各病毒生长曲线,结果显示,在各病毒的感染后期(感染后72 h),BHK-r JX15株的病毒效价显著高于亲本病毒(P<0.05),极显著高于T7-r JX15及293T-r JX15株(P<0.01);293T-r JX15的病毒效价极显著高于T7-r JX15株(P<0.01),但这两株病毒的效价又极显著低于亲本病毒(P<0.001)。且4株病毒的生长趋势基本一致。上述结果表明CMV启动子驱动的重组PRRSV(BHK-rJX15和293T-r JX15)复制水平高于T7启动子驱动的重组病毒(T7-rJX15),尤以CMV启动子驱动并通过BHK细胞拯救的重组病毒(BHK-rJX15)复制水平最高。提示,CMV启动子更适用于构建PRRSV的反向遗传操作系统。本研究为构建PRRSV反向遗传操作系统及其蛋白功能研究、新型疫苗的研发奠定了基础。

牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究

为探究与人受体相互作用蛋白激酶1 (RIPK1)存在互作的牛分枝杆菌(M.bovis) Mb0869c蛋白对细胞凋亡的作用机制,本研究通过PCR从M.bovis DNA中扩增Mb0869c基因片段后构建重组质粒p MN437-Mb0869c并经PCR和测序鉴定正确后,利用电转化法将重组质粒电转入耻垢分枝杆菌(MS)中,并经western blot鉴定Mb0869c蛋白的表达情况。结果显示,重组菌株中出现约55 ku的特异性条带,表明获得了表达Mb0869c的重组菌MS_Mb0869c。将MS_Mb0869c株和对照菌株MS_Vec分别感染人单核巨噬细胞(THP-1),通过PI和AnnexinⅤ/FITC染色,经流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,结果显示,MS_Mb0869c感染细胞的凋亡率显著低于MS_Vec感染组,这表明Mb0869c可以抑制MS诱导的细胞凋亡。将上述获得的Mb0869c基因片段克隆于p LVX-IRES-Puro-3×Flag中,构建的重组质粒经测序鉴定正确后,转染HEK293T细胞中,利用嘌呤霉素筛选表达Mb0869c的细胞并经western blot鉴定。结果显示,构建的HEK293T细胞中出现约55 ku的特异性条带,且随着细胞传代次数的增加,蛋白表达量未减少,这表明稳定表达Mb0869c的细胞系HEK293T/Mb0869c正确构建。利用不同浓度的肿瘤坏死因子α (TNF-α)和IAP抑制剂(SM164)作用于HEK293T细胞,通过检测细胞内ATP的含量确定细胞凋亡发生情况。结果显示,100 ng/mL TNF-α和25 nmol/L SM164在作用细胞24 h后,诱导细胞凋亡的效果最佳。以该浓度分别作用于HEK293T/Mb0869c和对照组HEK293T/Con细胞24 h后,统计细胞的存活率。结果显示前者的存活率极显著高于后者(P<0.01),表明Mb0869c能够抑制细胞凋亡。通过PCR扩增人RIPK1的3个结构域片段,并分别克隆至p CMV-Myc中构建真核表达重组质粒并经菌落PCR和测序鉴定正确后分别转染HEK293T/Mb0869c细胞,通过免疫共沉淀法(Co-IP)检测RIPK1结构域与Mb0869c的互作。结果显示Mb0869c和RIPK1的激酶结构域(KD)和中间结构域(ID)存在相互作用。上述结果表明,Mb0869c蛋白在M.bovis抑制细胞凋亡中具有重要的作用,且这种抑制作用是通过RIPK1实现的。本研究为M.bovis蛋白通过RIPK1调节细胞凋亡作用机制的研究提供实验依据。

单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究

为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-e基因组为模板,采用PCR扩增iiB^(man)基因与启动子片段,插入质粒pIMK2以构建回补质粒,经PCR和测序鉴定后,将缺失质粒转化LM EGD-e感受态细胞,通过氯霉素抗性及42℃压力下使重组质粒与LM EGD-e株的同源片段发生同源重组单交换获得一代同源重组菌株,然后在无抗性培养基中30℃培养使质粒丢失,获得缺失株ΔiiB^(man)。将回补质粒转化ΔiiB^(man)感受态细胞中,通过卡那霉素抗性筛选获得回补株CΔiiB^(man),缺失株和回补株均经PCR和测序鉴定。37℃培养EGD-e、ΔiiB^(man)、CΔiiB^(man)12 h,期间每隔1 h测定OD_(600nm)并绘制生长曲线,分析各菌株生长特性,结果显示,各菌株体外生长趋势相似。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示ΔiiB^(man)的运动圈直径分别是EGD-e的1.5及1.6倍(P<0.05、P<0.01),CΔiiB^(man)与EGD-e运动圈直径均基本一致。在各菌株培养上清中加入绵羊血,检测各菌株溶血能力,结果显示,ΔiiB^(man)的溶血能力较EGD-e及CΔiiB^(man)增强。将各菌株以MOI 20感染RAW264.7细胞,在感染后2 h、5 h和8 h收集细胞进行点样计数,结果显示,在感染后2 h和5 h时ΔiiB^(man)的胞内增殖能力较EGD-e及CΔiiB^(man)显著增强(P<0.05)。将各菌株以2×10^(5)cfu/只经腹腔注射感染小鼠48 h后剖杀,取肝脏和脾脏研磨并点样计数,结果显示,ΔiiB^(man)在小鼠脏器载菌量较EGD-e及CΔiiB^(man)极显著增多(P<0.001)。上述结果首次表明IIB^(man)不影响LM的生长,但影响LM的运动性及提高LM的体外溶血活性;IIB^(man)参与LM的胞内增殖和宿主脏器定植。本研究为了解LM PTS系统所介导的细菌体外环境适应及宿主感染的分子机制,以及LM感染的防控奠定了基础。

重组耻垢分枝杆菌MS_PE16的构建及其生物学特性研究

为探究牛分枝杆菌(M.bovis)PE/PPE家族成员PE16蛋白的生物学功能,本研究以M.bovis基因组DNA为模板扩增PE16基因片段并克隆至pMN437载体中,构建原核表达质粒pMN437-PE16,经PCR和测序鉴定正确后将该重组质粒及对照质粒PMS2电转入耻垢分枝杆菌中构建重组耻垢分枝杆菌MS_PE16及对照重组耻垢分枝杆菌MS_Vec。经western blot鉴定结果显示,重组耻垢分枝杆菌中PE16在55 ku左右正确表达,而MS_Vec则无该特异性条带。对MS_PE16及MS_Vec进行生长曲线测定,并利用倒置显微镜观察MS_PE16及MS_Vec的菌落形态;将培养至对数生长期的MS_PE16及MS_Vec分别以MOI 10感染人白血病单核细胞(THP-1细胞),感染后0(感染4 h后经庆大霉素处理2 h,此时计为0)、24 h、48 h时采用平板计数法检测胞内菌数量;细菌感染后24 h和48 h时收集各组细胞培养上清,利用ELISA试剂盒检测各组细胞IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-β的表达分泌水平。生长曲线测定结果显示,PE16对分枝杆菌的生长无显著影响;菌落形态观察结果显示,MS_PE16与MS_Vec的菌落形态无明显区别;胞内活菌数量检测结果显示,细菌感染后0和24 h,MS_PE16在THP-1细胞中的数量极显著低于MS_Vec(P<0.01),但在感染后48 h,MS_PE16在THP-1细胞中的存活率极显著高于MS_Vec组在THP-1细胞中的存活率(P<0.001);细胞因子检测结果显示,MS_PE16感染组细胞中IFN-β的分泌水平极显著高于MS_Vec组(P<0.01)。上述结果表明PE16对分枝杆菌的生长和菌落形态均无显著影响,但其可提高分枝杆菌在巨噬细胞内的存活率,且可促进巨噬细胞中IFN-β的分泌水平。本研究初步揭示了分枝杆菌PE16蛋白的功能,为M.bovis感染机制的进一步研究提供了实验数据。

大肠杆菌P88噬菌体gp52和gp53基因对其裂解活性和宿主谱形成影响的研究

为探究大肠杆菌溶原性噬菌体P88中非结构与功能基因gp52和gp53对其裂解活性和宿主谱形成的影响,本研究在P88宿主细菌K88基因组中对其进行基因工程操作,然后诱导出相应噬菌体进行功能研究。首先在大肠杆菌Red同源重组质粒p KD46基础上,融合p ST98-AS质粒的四环素抗性基因和I-Sce I核酸内切酶基因,构建缺失质粒p WRG99。利用质粒p WRG99分别构建大肠杆菌K88的gp52和gp53基因缺失突变株(Δgp52和Δgp53)并经PCR和测序鉴定。利用丝裂霉素C诱导Δgp52和Δgp53,采用双层平板法检测噬菌体的裂解活性,结果显示,Δgp52和Δgp53的诱导液可以在大肠杆菌DE048为宿主菌的平皿上形成清晰的噬菌斑,表明Δgp52和Δgp53能诱导出可以感染DE048的噬菌体(将该噬菌体命名为P88-52和P88-53),并且gp52和gp53基因缺失均不影响噬菌体P88的形成和裂解活性。将P88-52和P88-53纯化并经电镜观察,结果显示,P88-52和P88-53与野生株P88形态相似,具有P2-like噬菌体典型的肌尾和短尾丝特征,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体颗粒的形态。利用P88的宿主菌对P88-52和P88-53进行宿主谱分析,结果显示,P88-52和P88-53在DE048为宿主菌的平皿上均可以形成清晰的噬菌斑,在MC1061、DH5α和BL21为宿主菌的平皿上均不能形成噬菌斑,与噬菌体P88宿主谱相同,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体的宿主谱。综上所述,在宿主菌K88基因组的基础上缺失gp52和gp53基因后,诱导出的P88突变噬菌体的裂解活性和宿主谱均不受影响。本研究通过在宿主菌中对前噬菌体基因编辑来研究溶原性噬菌体的基因功能,为其他溶原性噬菌体基因功能的研究提供了参考依据。

AIM2炎症复合体活化体系的体外构建及初步应用

AIM2炎症复合体参与自身免疫性疾病和机体抵御病原体的过程,研究其激活机制具有重要的意义。为构建AIM2炎症复合体的体外活化体系,本研究通过PCR方法从人单核细胞(THP-1细胞)中扩增AIM2、ASC、pro-Caspase-1、pro-IL-1β基因片段后,构建重组质粒p3×Flag-AIM2、p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-Caspase-1和p3×Flag-pro-IL-1β,分别转染HEK293T细胞后采用western blot鉴定各蛋白的表达。结果显示,分别约在41.9 ku、34.1 ku、48.5 ku、24.6 ku处出现特异性条带,表明融合Flag标签的AIM2、ASC、Caspase-1和IL-1β蛋白在HEK293T细胞中获得了表达。除此之外,还可以在HEK293T细胞中检测到39 ku的内源性AIM2蛋白特异性条带,表明HEK293T细胞自身也表达内源性AIM2蛋白。将不同浓度比例的上述重组质粒转染或共转染HEK293T细胞,24 h后各组再转染poly(dA:dT),采用间接ELISA检测各组细胞中IL-1β的分泌水平。结果显示,空白对照组、p3×Flag-pro-IL-1β实验组和共转染p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-IL-1β实验组细胞上清中均未检测到IL-1β,共转染p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-Caspase-1、p3×Flag-pro-IL-1β和共转染p3×Flag-AIM2、p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-Caspase-1、p3×Flag-pro-IL-1β的实验组细胞上清中均能检测到高浓度的IL-1β,且共转染p3×Flag-AIM2的HEK293T细胞中IL-1β的分泌水平更高。此外,与对照组相比,poly(dA:dT)刺激后的各组HEK293T细胞中IL-1β的分泌水平极显著升高(P<0.001),表明AIM2炎症复合体的体外活化体系正确构建。将不同浓度的p3×Flag-AIM2与其它质粒共转染HEK293T细胞,并转染poly(dA:dT)作用,采用间接ELISA检测IL-1β的分泌水平,结果显示,无论是否转染poly(dA:dT),随着p3×Flag-AIM2的转染剂量的升高,IL-1β的分泌水平也显著或极显著升高(P<0.001、P<0.01、P<0.05、P<0.001),表明细胞中AIM2蛋白的表达量与AIM2炎症复合体的活性呈正相关。单核细胞增生性李斯特菌已被证实可以激活AIM2炎症复合体,利用该菌感染上述炎症复合体活化体系,6 h后采用LDH试剂盒检测各组细胞胞内细菌的存活情况。结果显示,细胞内单核细胞增生性李斯特菌的数量在感染2 h和6 h极显著低于不转染质粒的对照组(P<0.001、P<0.01),表明构建的AIM2炎症复合体活化体系发挥了抗细菌感染的作用。综上所述,本研究正确构建了AIM2炎症复合体活化体系,并初步通过该活化体系证实AIM2炎症复合体具有抗细菌感染的功能,为后续研究该活化体系的具体作用机制奠定了基础。

猪圆环病毒2型和3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的方法,参照GenBank上已登录的PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR检测方法,并对其进行特异性、灵敏性、可重复性检验。特异性试验结果显示,该方法除了对PCV2和PCV3的检测结果为阳性外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)检测均呈阴性,无交叉反应,特异性较强。敏感性试验结果显示,该检测方法同时检测猪圆环病毒2型和3型质粒标准品的最低检测极限均可达到10拷贝·μL^(-1),敏感性较高;该方法组内和组间的变异系数均小于2%,重复性较好。采集浙江省181份猪肉及全血样品,分别利用本文建立的检测方法与标准普通荧光PCR检测方法进行检测,结果显示,PCV2的阳性率为50.83%(92/181),PCV3的阳性率为37.57%(68/181),PCV2和PCV3共感染率为12.15%(22/181);而普通荧光PCR的上述检测结果分别为50.28%(91/181)、36.46%(66/181),共感染率为11.60%(21/181),两种方法对PCV2和PCV3的检测符合率分别可达98.91%和97.06%,对PCV2和PCV3混合感染符合率为95.45%。综上所述,本试验建立的双重荧光定量PCR检测方法可同时对PCV2和PCV3进行快速鉴别检测,可用于病原学检测和流行病学调查等。

宿主cGAS-STING信号通路调控机制的研究进展

先天性免疫识别系统是机体抵御原病侵入的第一道屏障,对于病原微生物的免疫防御至关重要。机体依赖先天性免疫识别系统中的特异性模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)监视病原微生物。一旦病原微生物侵入,机体PRRs通过感知病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pat-terns,PAMPs)或危险相关分子模式(Danger-associat-ed molecular patterns,DAMPs)识别病原并触发机体产生一系列的免疫保护反应[1]。

基于减毒单增李斯特菌递呈鸡柔嫩艾美耳球虫MIC3抗原的重组疫苗免疫保护效果的评估

本实验室前期构建的基于毒力基因改造的减毒单增李斯特菌(LM-1)被证实是一种较为安全的疫苗载体。为构建表达鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)毒力蛋白MIC3的重组减毒单增李斯特菌(LM)疫苗候选株并评估其对雏鸡的免疫保护效果,本研究在LM-1基础上采用同源重组的方法将MIC3蛋白关键功能区(aa159~aa252)编码基因(475 bp~756 bp)定点整合至LM-1基因组中,并与LM溶血素O(LLO,其编码基因为Rly)融合表达获得重组LM-1-MIC3菌株并经PCR鉴定;western blot检测LM-1-MIC3中MIC3和LLO的表达;测定细菌体外生长曲线检测LM-1-MIC3的体外生长能力;将野生菌株EGO-e、LM-1、LM-1-MIC3分别感染雏鸡72 h和144 h后,分别剖杀,取各组雏鸡肝脏和脾脏,经菌落计数对雏鸡肝脾载菌量进行测定并评估LM-1-MIC3在雏鸡体内的增殖能力;将野生株EGD-e、LM-1和LM-1-MIC3感染雏鸡并结合临床症状及致死率评估LM-1-MIC3对雏鸡的安全性;将LM-1-MIC3免疫雏鸡并建立E.tenella感染模型,研究其对雏鸡抗球虫感染的免疫保护效果。PCR鉴定结果显示正确构建重组菌株LM-1-MIC3;western blot结果显示LM-1-MIC3分泌的融合蛋白LLO-MIC3能够在培养上清液中大量表达;细菌体外培养结果显示LM-1-MIC3体外生长能力与EGD-e和LM-1无显著差异,表明融合LLO的MIC3不会影响LM-1的生长;雏鸡肝脾载菌量测定结果显示,与EGD-e组相比,各时间段LM-1-MIC3组雏鸡肝脾载菌量均极显著降低(P<0.01),感染LM-1-MIC3后雏鸡均存活且无明显临床症状,表明LM-1-MIC3对雏鸡致病力高度减弱,可以作为减毒疫苗载体;免疫保护试验结果显示在攻虫10 d后,LM-1-MIC3免疫组雏鸡的存活率高于LM-1免疫组及PBS对照组,且该组鸡无明显临床症状,剖杀后盲肠病变评分极显著低于LM-1和PBS组(P<0.001),表明LM-1-MIC3对雏鸡有良好的免疫保护效果。本研究构建了重组减毒株LM-1-MIC3,并证实该重组菌对雏鸡具有较好的免疫保护效果,为减毒LM载体疫苗在防控重要动物传染病中的研究与应用奠定了科学基础。

女贞子活性成分抗肝纤维化作用机制研究进展

肝纤维化为“肝病-肝纤维化-肝硬化/肝癌”的中间环节,存在于大部分肝病的发展过程中。有效逆转肝纤维化是防止其进一步发展的重要手段,但是目前还没有治疗肝纤维化的特效药,而女贞子Ligustri Lucidi Fructus作为一种天然药用植物,其活性成分具有抗肝纤维化功能。通过归纳梳理女贞子活性成分通过调控相关信号通路抗肝纤维化作用机制进行综述,为进一步对女贞子靶向治疗肝纤维化的研究提供理论参考。

朱鹮大肠杆菌分离鉴定及耐药性与喹诺酮类耐药基因分子特征分析

【目的】掌握浙江省德清县驯养朱鹮大肠杆菌的耐药性、耐药基因与分子特征,为治疗朱鹮大肠杆菌感染提供基础数据。【方法】采集该地驯养朱鹮新鲜粪便样本,采用分离培养、形态观察、生化鉴定及16S rDNA序列分析鉴定大肠杆菌;进而采用肉汤稀释法检测环丙沙星、庆大霉素、丁胺卡那等7种抗菌药对源自不同朱鹮的大肠杆菌分离株菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);选择代表性菌株,通过PCR和测序鉴定其携带qnrS 1、gyrA、gyrB等9种喹诺酮类耐药基因的情况,并分析其蛋白关键氨基酸位点突变与耐药性的关系,采用接合转移分析耐药质粒水平转移情况及其与耐药性的关系,应用卡方检验(Chi-square test)和费歇尔精确检验(Fisher exact test)分析分离株耐药表型与朱鹮年龄、耐药基因的相关性。【结果】本研究共采集了98只朱鹮的粪便,经分离鉴定均获得了大肠杆菌;源自不同朱鹮的98株大肠杆菌对喹诺酮类环丙沙星呈现高度耐药(耐药率为65.3%,64/98),对其余6种药物高度敏感(敏感率均>90%),朱鹮年龄与环丙沙星耐药性极显著相关(P<0.01);选取的31株分离株喹诺酮类耐药基因marR、gyrA、parC和gyrB的突变株占比在3.2%~80.6%之间,携带质粒耐药基因qnrS 1的菌株占比22.6%(7/31);耐药基因阳性菌株占比93.5%(29/31)并分布于6个耐药基因型,其中,marR/gyrA/parC 10株、marR/qnrS 16株、marR 6株、gyrA/parC 3株、marR/gyrA 3株、marR/gyrB/qnrS 11株;环丙沙星耐药表型与耐药基因显著相关(P=0.026),gyrA和parC单基因或联合突变均与喹诺酮耐药显著相关(P=0.038);大肠杆菌分离株qnrS 1基因一次接合成功率为28.6%(2/7),并可导致受体菌对喹诺酮类药物的耐药性增加。【结论】本研究鉴定了朱鹮群体大肠杆菌耐药性,并明确了朱鹮源大肠杆菌对喹诺酮类耐药的主要原因是gyrA和parC单基因或联合突变并携带可水平转移的耐药基因qnrS 1,本研究结果为人工驯养朱鹮救护和耐药性监测提供参考依据,提示应重视朱鹮大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药性。

壬基酚诱导肝细胞氧化损伤及铁死亡机制研究

旨在研究壬基酚(nonylphenol,NP)致肝细胞损伤的机制。通过建立NP诱导BRL-3A肝细胞损伤体外模型,评估肝细胞氧化损伤标志物变化、肝细胞Fe^(2+)含量变化,观察肝细胞超微结构,检测铁死亡标志蛋白表达水平。结果显示,NP可引起BRL-3A细胞ROS、MDA显著升高(P<0.05);GSH含量、GSH-Px活性和SOD活性显著降低(P<0.05);Fe^(2+)含量显著升高(P<0.05),并呈现剂量依赖性;BRL-3A细胞线粒体体积明显变小,线粒体嵴断裂甚至消失,有的线粒体呈现空泡化;铁稳态相关蛋白TFR1和FTH1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结果表明,铁死亡参与NP诱导肝细胞损伤机制,为深入探究NP致病机理提供了参考。

单增李斯特菌毒力因子溶血素关键氨基酸位点在感染过程中的作用研究

【目的】探究单增李斯特菌溶血素O(listeriolysin O,LLO)中D3区域β8折叠片上第253位氨基酸(谷氨酰胺,Q)和第254位氨基酸(异亮氨酸,I)对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)感染生物学功能的影响。【方法】构建LLO_(Q253A)和LLO_(I254A)突变蛋白的原核表达菌株,以及利用同源重组方法构建hly_(Q253A)和hly_(I254A)突变株;通过表达纯化突变蛋白,测定溶血活性;比较LLO第253位Q和第254位I均突变成丙氨酸(A)后,对细菌体外生长能力、黏附侵袭、胞内迁移和增殖能力的影响。【结果】相应位点突变后,LLO蛋白均能够正常表达。在pH 6.5条件下,所有突变蛋白和突变株的溶血活性丧失。然而,在pH 5.5条件下,LLO_(I254A)和hly_(I254A)恢复了溶血活性。与野生株相比,突变株的体外生长、黏附能力和胞内增殖能力均无明显差异;突变株的侵袭能力和胞间迁移能力显著低于野生株。【结论】本研究证实第253位Q和第254位I均突变成A后,单增李斯特菌在pH 6.5条件下丧失溶血活性,并降低了感染宿主细胞的能力,但具体机制还有待进一步探索。本研究为深入探究LLO结构对单增李斯特菌生物学功能的影响奠定基础,对单增李斯特菌点突变株的构建具有一定参考意义。

3C样蛋白酶:重要抗PEDV药物的筛选靶标

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)成员。由于冠状病毒的RNA酶缺乏校正功能,PEDV等冠状病毒的基因组易发生变异。