一例猪细小病毒2型和3型混合感染的实验室诊断

四川省凉山州某规模化猪场的初产母猪出现流产、产死胎等情况,而母猪本身无明显症状,为探明发病原因,本试验采集病料进行实验室诊断。通过发病情况、细菌检测和PCR检测,证明该病为猪细小病毒2型和猪细小病毒3型混合感染所致。

一例猪圆环病毒2型和3型混合感染的实验室诊断

猪圆环病毒病是一种以仔猪多系统衰竭、呼吸障碍和母猪繁殖障碍为主要特征的疾病,其病原为猪圆环病毒(PCV),在我国各地区猪场广泛存在,其中猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)是我国的主要流行毒株,分别于2001年和2017年在我国猪群中首次发现。某规模化猪场2022年1月发现存在断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、母猪繁殖障碍和增生性坏死性肺炎(PNP)为特征的急性传染病,根据临床诊断和实验室分析,确定为一例猪圆环病毒2型与3型混合感染的病例。

新型鹅细小病毒四川株的全基因组扩增及遗传进化分析

【目的】了解四川地区新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的分子生物学特征及遗传变异情况。【方法】根据Gen Bank中发表的新型鹅细小病毒的全基因组序列,设计5对兼并引物采用PCR方法分段扩增新型鹅细小病毒四川株的全基因组序列,并利用DNAstar等生物信息分析软件对获得的基因组序列进行分子特性与遗传演变分析。【结果】获得的新型鹅细小病毒四川株(命名为SC16)全长5 109 nt,5′端ITR长408 nt,3′端ITR长407 nt,NS基因长1 884 nt,VP基因长2 199 nt。序列比对和遗传进化分析显示,SC16株与山东分离株SDLC01(KT343253.1)及QH15(KT751090.1)的基因组核苷酸同源性高达99%,与两者的亲缘关系最近,基于NS及VP蛋白的氨基酸序列系统进化树分析结果与此一致。但SC16株的5′端ITR还是发生了一定的变异:与SDLC01及QH15相比,多了几个14 nt的插入片段。【结论】研究结果丰富了NGPV的分子生物学资料。

动物疱疹病毒基因工程疫苗的研究进展

疱疹病毒是一类具有相同形态和较大囊膜的双链DNA病毒,它不仅能引起原发性感染,还能引起潜伏性感染和复发性感染。此外,某些疱疹病毒是哺乳动物和禽类等动物肿瘤的病原因子,因此防制此病毒病不容忽视。疫苗的免疫接种是预防、控制该病毒病的主要手段。文章在简单介绍动物疱疹病毒常规疫苗的基础上对动物疱疹病毒基因工程疫苗进行了综述,并对动物疱疹病毒基因工程疫苗今后的发展方向进行了总结,以期为动物疱疹病毒基因工程疫苗的深入研究提供借鉴。

高致病性维氏气单胞菌胞外产物对斑点鲖的致病性

为了研究维氏气单胞菌及其胞外产物的致病机制对预防和治疗斑点鲖维氏气单胞菌病的作用。通过对一株高致病性斑点鲖源维氏气单胞菌胞外产物（extracellular product,ECP）的提取并结合体内外实验研究其酶活性与致病性,以期为维氏气单胞菌的致病机制研究提供新思路。采用饱和硫酸铵沉淀法,对一株高致病性的斑点鲖源维氏气单胞菌的ECP进行了提取,将其进行浓度检测、SDS-PAGE分析和酶活测定;并将提取的ECP攻毒斑点鲖,通过病理学分析研究其致病机制。提取的ECP经考马斯亮蓝试剂盒确定其浓度为0.743 mg/mL;SDS-PAGE分析发现该ECP类型丰富,分子大小主要集中在20.0～33.0 ku。运用琼脂平板扩散法对ECP中主要毒力和代谢相关酶活性进行体外测定,发现ECP具有脂酶、蛋白酶、卵磷脂酶、DNA酶和溶血活性,不具有淀粉酶、明胶酶、脲酶活性;并对与毒力密切相关的溶血活性进行了进一步的溶血谱绘制,发现ECP对其他多种动物红细胞都有溶血活性,对鱼类红细胞溶血性较强,但对鸡、鸭红细胞无溶血活性。ECP攻毒健康斑点鲖后,发现其具有明显致病性,死亡率高达100%。病鱼大体病理变化为体表黏液增多,出现褪色斑以及不同程度的出血斑;眼球充血;肛门红肿外凸;剖检病变表现：鳃丝充血肿胀、肝脏肿大、散在少量出血点,脾脏肿大暗红,肠道扩张、肠壁变薄、肠腔内有大量黄色黏液。组织学病变主要表现为肝细胞变性、坏死;脾脏淋巴细胞减少,大量结缔组织增生;胃、肠道黏膜上皮坏死脱落。该株维氏气单胞菌的胞外产物具有多种酶活性,且对斑点鲖具有明显的致病性,推测该胞外产物在维氏气单胞菌入侵、感染甚至致死斑点鲖过程中都发挥了重要作用。

应用TaqMan-MGB探针FQ-PCR探讨鸭瘟弱毒苗在鸭体内的分布及排泄规律

用鸭瘟病毒(DPV)Cha株弱毒苗皮下注射免疫20日龄樱桃谷鸭,应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)对免疫后10、30、609、0 min及12、24 h和6、9、12、21、366、0 d鸭的心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、回盲处、血液、气管、气管分泌液、食管及其分泌液、十二指肠、空肠、回肠、肓肠、直肠及各肠段分泌液中DPV-DNA的拷贝数(以对数值表示)进行了检测。结果显示,免疫后10 min即可在胸腺和血液中检测到DPV-DNA;60 min肾脏中DPV-DNA拷贝数最高(9.349);脾(9.932)、脑(9.791)、胸腺(9.736)、法氏囊(9.598)及哈德氏腺(8.135)中DPV-DNA拷贝数于90 min分别达到最高;12 h后所有受检样品中都能检测到DPV-DNA,其中心脏中DPV-DNA拷贝数最高(9.818);肠道中DPV-DNA拷贝数在免疫后6~12 d明显高于其他组织,其中盲肠是DPV-DNA拷贝数(10.591)最高的受检样品,直肠分泌液中DPV-DNA最早于90 min检测到。研究表明,免疫鸭于免疫早期在包括主要免疫器官在内的各实质...

大肠杆菌属16S rDNA实时荧光定量PCR方法的建立及应用

根据GenBank大肠杆菌属16S rDNA基因序列设计并合成PCR引物及针对大肠杆菌属的特异Taqman探针,以大肠杆菌标准菌株的PCR扩增产物作为阳性模板制定标准曲线,建立大肠杆菌属实时荧光定量PCR检测方法。该法Mg2+最佳工作浓度5 mmol/L,探针最佳工作浓度0.12μmol/L,标准曲线相关系数为0.998,能够定量和特异性检测大肠杆菌而与肠道优势菌群的代表种葡萄球菌、双歧杆菌和芽孢杆菌呈阴性反应,检测大肠杆菌16S rDNA基因的灵敏度达40.8 copies/μL。应用建立的方法对20、26、324、1、47、56日龄樱桃谷鸭的气管、食道、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠进行检测结果表明(以每个细菌含1个16S rDNA基因拷贝数计),大肠杆菌属细菌总量,气管内为7.06×107～3.01×108个;食道内为1.73×108～3.23×108个;十二指肠内为2.29×108～2.39×109个;空肠内为1.28×108～1.69×109个;回肠内为1.86×108～1.90×1010个;盲肠内为6.01×108～1.38×109个;直肠内为1.07×108～4.67×1010个。樱桃谷鸭从食道到直肠的大肠杆菌属细菌的数量呈现上升趋势,盲肠和直肠分布量较多。

鸭瘟病毒强毒株在感染鸭实质器官内的增殖与分布

鸭瘟病毒(DPV)CHv强毒株经皮下注射、滴鼻和口服3种途径分别感染20日龄天府肉鸭,于攻毒后10、30、60、90min以及4、12、48、72h和9、15d每组分别剖杀2只鸭,采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、法氏囊、哈德氏腺等实质器官,应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR对DPV在这些器官的分布和增殖进行检测。结果表明,DPV分布到具体器官的速度与感染的途径、鸭的解剖结构密切相关,其中皮下注射是DPV分布到各实质器官速度最快的途径。30min于皮下感染鸭的肝、脾、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、肺、脑、肾,口服感染鸭的肺和法氏囊,滴鼻感染鸭的心脏和哈德氏腺均检测到DPV-DNA;90min所有受检样品中检测到DPV-DNA。鸭抗DPV感染的免疫器官的重要性依次是脾、胸腺、法氏囊和哈德氏腺,30min内DPV-DNA分布到脾、胸腺、法氏囊的速度和数量决定了DPV感染的潜伏期和疾病的严重程度。不同途经感染鸭的相同器官在同一时间内的DPV-DNA拷贝数大多以皮下感染鸭为最高。DPV致死鸭的法氏囊和肾是DPV-DNA含量最高的实质器官。

南方鲇(Silurus meridionalis)豚鼠气单胞菌溶血素的分离、纯化与致病性研究

采用硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A50凝胶层析法对豚鼠气单胞菌的溶血素进行分离、纯化,获得分子量为32.2kDa的单一多肽溶血素,测定溶血价为25。将该溶血素倍比稀释后梯度接种南方鲇,研究其对南方鲇的致病性和组织病理损伤情况。结果表明:豚鼠气单胞菌溶血素具有较强的毒力,对南方鲇的半数致死剂量(LD50)为0.29mg蛋白/kg体重;病鱼表现为体表褪色,腹部膨大,肝、脾、肾肿大,肝、脾淤血、出血明显;胃肠道内充有大量粘液,黏膜充血、出血;组织病理学表现为骨骼肌水肿、变性,肝细胞变性、坏死,血窦扩张淤血,肾小管上皮细胞变性、坏死,脾脏淋巴细胞减少,胃肠道黏膜上皮变性、坏死,脱落。

大豆异黄酮对大鼠肠道上皮内淋巴细胞、杯状细胞及瘦素长型受体的影响

大豆异黄酮具有广泛的生理作用,其对免疫系统的影响近年来成为一个焦点。为了研究大豆异黄酮对肠黏膜屏障结构的重要组成部分(上皮内淋巴细胞、杯状细胞)及免疫调节因子瘦素受体(长型)的影响,本实验采用高脂饲料喂饲大鼠,建立肥胖模型;然后将筛选出的肥胖大鼠分别灌胃剂量为对照(I:0mg/kg)、低(Ⅱ:50mg/kg)、中(Ⅲ:150mg/kg)、高剂量(Ⅳ:450mg/kg)的大豆异黄酮,并设置基础对照组(Ⅴ:溶媒为0.5%羧甲基纤维素钠),连续4周用HE、PAS染色观察小肠上皮内淋巴细胞、杯状细胞数量和分布变化;用免疫组织化学SABC法测定瘦素受体(长型)水平。结果表明:大鼠上皮内淋巴细胞以小型淋巴细胞为主,主要分布于上皮的基底膜附近;大鼠杯状细胞分布在肠黏膜上皮层;瘦素受体(长型)阳性细胞分布于黏膜层。应用大豆异黄酮高剂量组较对照组大鼠的肠黏膜上皮内淋巴细胞数量和杯状细胞的数量明显增加,且有向肠内层移动趋势,同时肠黏膜瘦素受体(长型)水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。表明大豆异黄酮在一定程度上可促进大鼠小肠黏膜屏障结构趋于完整并提高其免疫功能。

皮下注射鸭瘟弱毒苗诱导鸭局部黏膜和系统免疫中IgA、IgM和IgG的发生规律

为探讨鸭瘟弱毒苗诱导鸭局部黏膜和系统免疫中抗体发生的规律,将鸭瘟病毒Cha株弱毒苗皮下注射免疫20日龄樱桃谷鸭后60d内定时随机剖杀5只鸭,采集血清、胆汁、气管和消化道(食道、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠)分泌液,应用间接ELISA检测抗DPV的IgA、IgM和IgG滴度(以Log10表示)。结果表明:①血清:抗体滴度由高到低为IgG、IgM和IgA,相应的检测到的时间段分别为免疫后6～60,3～15,12～36d。②胆汁:抗体滴度由高到低为IgA、IgG和IgM,相应的检测到的时间段分别为免疫后9～21,15～27,3～12d。③分泌液:气管和消化道分泌液中抗体滴度由高到低均为IgA、IgM和IgG,其中IgA抗体滴度由高到低为十二指肠、食道、气管、空肠、盲肠、回肠和直肠,相应的检测到IgA的时间段分别为免疫后3～60,9～60,3～60,9～60,12～60,12～27,6～36d;IgM由高到低为气管、食道、十二指肠、空肠、盲肠、直肠和回肠,相应的检测到IgM的时间段分别为免疫后3～12,6～15,3～12,6～12,9～12,6～9,6～9d;IgG由高到低为食道、十二指肠、气管、空肠、盲肠、直肠和回肠,相应的检测到IgG的时间段分别为免疫后9～36,12～27,6～36,9～36,12～36,9～21,15～21d。综上,鸭瘟弱毒疫苗皮下免疫鸭后,IgM和IgG分别是系统免疫中体液免疫的先锋抗体和主要抗体;IgA是气管、消化道和胆汁中的主要抗体。

虹鳟Ⅰ型干扰素e7在胖头鳜肌肉细胞中的表达及其抗传染性造血器官坏死病毒活性检测

为表达虹鳟Ⅰ型干扰素e7(IFNe7),并检测其抗传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的活性,本实验采用RT-PCR从虹鳟肾脏组织中扩增虹鳟IFNe7基因,克隆至p MD19-T载体,测序分析后构建重组真核表达载体p EGFP-IFNe7,并转染至胖头鳜肌肉细胞(FHM)检测其抗病毒活性。结果显示,虹鳟IFNe7基因序列为561 bp,编码186个氨基酸,与大西洋鲑Ⅰ型干扰素(IFN-I)亲缘关系最近。通过荧光观察、RT-PCR及western blot方法鉴定显示,真核表达载体p EGFP-IFNe7能在FHM细胞中表达49 ku的重组蛋白;采用细胞病变抑制法表明IFNe7具有抗IHNV的活性。本研究为进一步研究虹鳟病毒性疾病奠定基础。

大豆异黄酮对肥胖大鼠弓状核及垂体α-MSH、POMC、Ob-Rb 表达的影响

为了探究大豆异黄酮通过瘦素减重的作用机制,建立食源性肥胖大鼠模型,后进行低、中、高剂量(50,150,450 mg/kg)大豆异黄酮干预,并每周定期称量记录体重,采用苏丹Ⅲ染色、SABC免疫组织化学法和核酸原位杂交法,观察大豆异黄酮对肥胖大鼠体重、腹部脂肪细胞形态和下丘脑弓状核及垂体α-MSH、POMC mRNA、Ob-Rb mRNA表达的影响。结果显示,标准对照大鼠α-MSH在弓状核、垂体神经部和中间部均大量表达,POMC mRNA在弓状核和垂体仅少量表达,Ob-Rb mRNA仅在弓状核表达,同时肥胖大鼠3种因子表达均显著降低;大豆异黄酮干预后肥胖大鼠体重降低,腹部脂肪细胞面积缩小且形态分布明显改善,同时α-MSH、POMC mRNA、Ob-Rb mRNA表达增多。表明大豆异黄酮可能通过减少脂储、增加Ob-Rb表达从而促进具有抑食作用的POMC及其裂解物α-MSH产生,从而改善大鼠瘦素抵抗状态,发挥减重作用。

Ⅱ型糖尿病猕猴部分靶器官中Th1/Th2型细胞因子表达分析

检测Ⅱ型糖尿病猕猴部分靶器官中Ⅰ型辅助T细胞(Th1)因子IL-2和IFN-γ以及Ⅱ型辅助T细胞(Th2)因子IL-4、IL-10的表达及分布变化情况,研究Th1/Th2型细胞因子在Ⅱ型糖尿病发病中的变化。取Ⅱ型糖尿病及健康猕猴胰腺、肝、肾和心脏,通过石蜡切片、常规染色观察病理变化,同时采用免疫组织化学SABC法检测各靶器官IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的表达及分布情况。病理结果显示:糖尿病猕猴肝血窦增宽伴中性粒细胞浸润,肾、心脏和胰腺细胞呈不同程度肿胀、萎缩及坏死。免疫组织化学结果显示:在肾中Th1型细胞因子IFN-γ表达水平高于健康组(P<0.01)并分布于近曲小管、远曲小管及集合管。胰腺中IFN-γ表达水平与健康组相比差异无统计学意义(P>0.05),阳性产物分布于胰岛部及外分泌部。胰腺及肾中Th1型细胞因子IL-2表达水平与健康组相比差异无统计学意义(P>0.05)。胰腺及肾中Th2型细胞因子IL-4表达水平显著低于健康组(P<0.01),阳性产物分布于远曲小管、胰腺胰岛及外分泌部。在胰腺、肾、肝及心脏中,Th2型细胞因子IL-10表达水平显著高于健康组(P<0.01),阳性产物分布于近曲小管、远曲小管、胰腺胰岛、胰腺外分泌部、心肌细胞及肝细胞的胞质中。Th1/Th2型细胞因子在Ⅱ型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)的发病过程中发生了显著变化。

维生素E对斑点叉尾胃肠道生长抑素表达的影响

生长抑素（Somatostatin，缩写为SS或SRIF）由生长抑素细胞分泌，是一类抑制动物生长的多肽类激素。1973年Brazeau，et al．首先从绵羊下丘脑中分离到生长抑素，并发现其具有抑制垂体生长激素释放的功能。随后的研究发现在圆口动物、软骨鱼类、硬骨鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、哺乳类等均有生长抑素SS的分布。目前SS已被确认为一种广泛分布于神经组织和胃肠道的多功能肽，具有激素和神经递质双重作用，调节机体的生长、发育和代谢等多种生理过程。

基于鹅T细胞表面CD4分子胞外区的双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立鹅CD4分子(goCD4)双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以鼠抗goCD4-exc多克隆抗体为包被抗体,兔抗goCD4-exc多克隆抗体为检测抗体,确立判定标准,优化反应条件,建立了goCD4DAS-ELISA的检测方法。试验结果显示该方法最低检出量达5 pg/mL,具有较好的灵敏度。批内批间变异系数均低于2%,具有较好的重复性。将建立的双抗体ELISA方法初步应用于检测小鹅瘟病毒(GPV)感染的鹅脾单核细胞中CD4分子表达水平变化情况,结果显示GPV感染鹅脾单核细胞中goCD4分子表达水平极其显著高于未感染组。本研究建立的检测goCD4的DAS-ELISA方法有利于进一步研究禽类细胞免疫水平变化,并对实际生产中禽病检测及防控提供技术参考。

大豆异黄酮对去卵巢大鼠脾脏NGF、IL-2蛋白表达的影响

为了探讨大豆异黄酮(SI)对去卵巢大鼠脾脏中神经生长因子(NGF)、白细胞介素2(IL-2)蛋白表达的影响,本研究在成功建立去卵巢大鼠模型的基础上,对去卵巢大鼠分别隔天皮下注射高(1.5 mg·kg^-1)、中(1.0 mg·kg^-1)、低(0.5 mg·kg^-1)剂量的SI,假手术组(仅手术而不去卵巢)和溶媒组(去卵巢)大鼠隔天皮下注射溶媒剂(乙醇)。补充SI至14 d和42 d时,每组随机剖杀5只大鼠,采用免疫组织化学方法,对大鼠脾脏NGF、IL-2蛋白的表达变化进行研究。结果表明,脾脏中广泛分布着NGF、IL-2蛋白,主要分布于被膜下方的红髓区,在白髓分布量极少。去卵巢后,大鼠脾脏中NGF、IL-2蛋白的表达强度和阳性细胞数目均显著下降,而且随着去除卵巢时间的延长下降加剧。体外补充SI后14 d,各剂量组和42 d低、中剂量组仅有部分恢复,变化不显著;补充高剂量SI 42 d后,脾脏NGF、IL-2蛋白的表达强度和阳性细胞数目基本恢复至假手术组的水平。大豆异黄酮能上调NGF、IL-2蛋白在脾脏内的表达,并呈现时间和剂量的依赖性。

斑点叉尾鲖BPI1基因的原核表达及生物信息学分析

为探究斑点叉尾鲖BPI1抗菌肽基因编码蛋白的结构特征,实验提取斑点叉尾鲖肾脏RNA,根据BPI1基因序列设计引物,利用PCR方法克隆BPI1基因并构建至原核表达载体p TWIN1中。构建成功的重组质粒p TWIN1-BPI1经原核表达,SDS-PAGE检测显示得到约为50 ku的融合蛋白,与预期结果相一致。通过生物信息学软件对BPI1基因编码的蛋白序列进行分析,结果显示,克隆所得斑点叉尾鲖BPI1基因编码一条由223个氨基酸残基组成的多肽,等电点为9.07,属于BPI超家族,是稳定的亲水蛋白。亚细胞定位BPI1分布在线粒体(43.5%)、细胞质(30.4%)和细胞核(26.1%)中,表明BPI1可能在嘌呤和嘧啶合成以及能量代谢等过程中发挥信号转导、促进生长等重要作用。二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,三级结构呈棒状。同源性及进化树分析表明,实验所得BPI1基因序列与斑点叉尾鲖BPI抗菌肽基因的同源性最高,序列一致性为99.1%,进化树聚为一支,表明BPI1基因编码的蛋白序列在相同物种中的突变率较低,保守性较高,相同物种中其生物活性与个体间的差异关系较小。

感染微生态及鸭重要致病微生物感染和免疫微生态研究进展

本文介绍了感染微生态及其主要研究方法的研究进展,以及鸭重要致病微生物感染和免疫微生态研究若干进展。