白三叶转录组SSR位点特征分析及引物开发

本研究旨在了解白三叶(Trifoliumrepens)SSR位点信息和序列特征,开发多态性SSR引物,区分20份白三叶材料。对白三叶不同颜色的花瓣进行转录组(RNA-seq)测序,并根据转录组测序结果中的SSR位点批量设计引物,随机选择60对引物进行多态性验证,选择多态性高的引物指纹图谱构建。结果表明,白三叶转录组中含有SSR位点的序列有24960个,出现频率为13.25%,平均约5.29 kb出现1个SSR位点;白三叶转录组SSR重复碱基类型有6种,其中三碱基重复占比最高(33.70%),其次为双碱基(28.26%)和单碱基重复(25.02%),其他碱基重复类型较低,仅占总SSR的9.01%。A/T(24.85%)、AG/CT(16.48%)和AAG/CTT(8.89%)分别为单碱基到三碱基的优势重复单元;单碱基至六碱基各基元重复次数集中在4~21次,占总数量的98.11%;序列长度变化在12~35 bp,占总数的96.43%;根据SSR位点序列设计出18594对引物,占总SSR的74.50%;60对随机引物中能扩增出条带的有52对,多态性引物17对,分别占86.7%和32.7%;以多态性较高的5对引物构建的白三叶指纹图谱,能够有效地将20个不同白三叶品种区分开。本研究中白三叶转录组SSR位点分布频率高,类型丰富,具有较高的多态性,在白三叶遗传多样性分析、分子标记辅助育种和指纹图谱构建中具有较大的应用潜力。

白三叶类黄酮合成基因TrCHI的克隆及转录分析

为研究白三叶类黄酮合成途径的关键基因TrCHI在白三叶(Trifolium repens)花色形成中的作用,以白三叶野生型和红花突变体为材料,通过同源克隆得到TrCHI基因并进行转录分析和CHI酶活性测定。结果表明,白三叶野生型TrCHI基因开放阅读框长660 bp,编码219个氨基酸,其红花突变体TrCHI开放阅读框长度为669 bp,编码222个氨基酸。7处氨基酸突变包括:第13号位的谷氨酸突变成天冬氨酸,第75号位的谷氨酸突变成谷氨酰胺,第154号位的丝氨酸突变成苏氨酸,第218号位的赖氨酸突变成精氨酸,并在末尾增加了甘氨酸、蛋氨酸和赖氨酸。进化分析发现,CHI基因进化具有物种保守性,Tr CHI属于Ⅱ型CHI。花瓣、根和叶柄中,红花突变体TrCHI转录水平显著高于野生型;但在茎、叶和花梗中,红花突变体TrCHI基因转录水平低于野生型。突变体花瓣中CHI酶活性极显著高于野生型(P<0.001)。推测白三叶突变体的红花表型与TrCHI基因突变并对白三叶中的类黄酮化合物的合成调控有关。本研究为进一步研究TrCHI在白三叶上的潜在功能提供了一定的价值。

白三叶TrDFR基因克隆及表达分析

【目的】二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花色素苷生物合成途径上的关键调节酶,探究其基本性质和在白三叶花色形成过程中的作用对白三叶育种具有重要意义。【方法】以野生型和红花突变体白三叶为材料,克隆白三叶TrDFR序列,并对其进行生物信息学分析和组织表达分析。【结果】白三叶红花突变体中TrDFR序列开放阅读框长969 bp,编码合成322个氨基酸。TrDFR蛋白分子量为36.59 kD,属于不稳定的亲水非分泌蛋白;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,和红三叶的进化关系最近。组织表达分析表明,TrDFR基因在白三叶花瓣、叶柄和花梗中大量表达,且红花突变体茎和花瓣中的表达量显著高于野生型(P<0.01)。【结论】TrDFR基因可能与白三叶花瓣中花色素苷的合成有重要关系,为进一步研究TrDFR在白三叶花色形成调控中的功能提供了一定的理论基础。