荞麦生物活性物质的研究进展

荞麦是一种古老的杂粮作物,在世界一些国家和高寒地区都有种植,在某些地区还是当地的主要粮食作物。由于它的化学和生物学成分独特,目前在食品和医药方面的应用前景十分广阔。本文对其生物活性物质,尤其蛋白酶抑制剂的理化性质及其功能等进行了综述。

黄芪等5种中药对小鼠辐射损伤防护作用的实验研究

随着核工业和放射医学的快速发展，电离辐射对人体的损伤越来越受到重视。大剂量的辐射对人体各系统均有损伤，其中造血系统和免疫系统最为敏感。电离辐射为非特异性刺激，作用于机体引起器官、组织、淋巴细胞最终导致免疫系统功能下降。由于造血系统和免疫系统对电离辐射极为敏感，在辐射防护中增强对造血系统和免疫系统的保护是非常必要的。中医药在辐射损伤的防治中具有一定的作用。

新的蒽醌类衍生物1-硝基-2-酰基蒽醌-苯丙氨酸通过抑制NF-κB/p65信号通路降低乳腺癌MCF-7细胞的迁移能力

肿瘤细胞的侵袭和转移与大多数癌症患者的死亡率密切相关。了解肿瘤细胞的迁移机制可为阻断肿瘤细胞的转移提供一个关键的策略。蒽醌衍生物具有一定的抗肿瘤作用,我们结合抗肿瘤药物的作用机制以及蒽醌类衍生物的构效关系,设计合成了一类新的酰胺蒽醌衍生物1-硝基-2-酰基蒽醌-苯丙氨酸(简称C7),发现其具有很好的抗肿瘤活性。为了探究蒽醌类衍生物C7对人乳腺癌MCF-7细胞迁移的作用及其机制,本文首先采用MTT比色法检测蒽醌类衍生物C7对人乳腺癌细胞MCF-7生长活力的影响,结果证明较高浓度(60~100μg/m L)的蒽醌类衍生物C7对乳腺癌MCF-7细胞的增殖具有明显的抑制作用。其次,采用细胞划痕实验检测C7对MCF-7细胞迁移的影响,发现较低浓度(20~40μg/m L)的蒽醌类衍生物C7可以显著降低MCF-7细胞的迁移率。为进一步探究C7抑制MCF-7细胞迁移的分子机制,通过免疫荧光技术检测NF-κB/p65蛋白的核转位情况;同时利用qRT-PCR及Western印迹实验检测C7对MCF-7细胞中NF-κB/p65通路及迁移相关基因和蛋白质表达的影响。结果表明C7可以下调细胞质中IκBα的磷酸化,降低NF-κB/p65蛋白的核转位,减小MMP-2和MMP-9蛋白的表达。因此,C7可能是通过抑制NF-κB/p65信号通路的活化,抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达,进而抑制MCF-7细胞的迁移。

黑曲霉IN7-31产糖化酶的液态发酵参数与技术优化研究

通过N+注入、氯化锂一紫外线复合诱变方法选育了一株高产糖化酶黑曲霉IN7-31(Aspergillus niger)菌株,采用响应面法对该菌株产糖化酶的液态发酵工艺条件进行了优化。首先,通过前期的预实验,筛选出了对发酵工艺影响较大的三个培养基成分和两个培养条件,然后,分别对这两组进行了最陡爬坡实验,用最陡爬坡试验逼近最大响应区域,通过中心组合实验及响应面法分析优化了这几个因素,并进行了优化后的验证实验。利用SAS软件分析得到该菌株产糖化酶的最佳工艺条件为:玉米粉56.5g/L,豆粉22.0g/L,K2HPO4 1.3g/L,pH值为6.40,装液量80.8mL/250mL三角瓶,在此条件下摇瓶发酵黑曲霉产糖化酶的最大酶活为3044U/mL,比优化前提高了1.59倍。结果表明,通过响应面试验得到了产糖化酶黑曲霉液态发酵最佳工艺条件,可以为糖化酶的工业化生产提供一定的技术参数与条件。

Potato Ⅰ型蛋白酶抑制剂rBTI及其突变体的表达、纯化和活性研究

荞麦胰蛋白酶抑制剂(BTI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂Potato I家族,典型构象中有1段暴露在分子外侧的结合区,该区内P1'、P2、P6'与P8'位的氨基酸残基具有高度保守性.本文依据近期解析的rBTI晶体结构以及rBTI与胰蛋白酶复合物晶体结构信息,对rBTI中的P2和P8'位氨基酸进行突变,构建了pExSecI-Bti-P44T和pExSecI-Bti-W53R重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,通过Resource Q阴离子交换层析和Superdex G 75 HR 10/300凝胶柱进行分离纯化后,测定了rBTI及其突变体对胰蛋白酶的抑制常数,以及它们对HepG2细胞内的蛋白酶体和细胞增殖的抑制作用.实验结果显示,rBTI的44和53位分别突变为Thr和Arg后,Ki分别为2.91×10-9mol/L和2.97×10-7mol/L,前者较rBTI(Ki=3.56×10-8 mol/L)降低1个数量级,而后者较rBTI升高1个数量级.功能分析显示,rBTI及2种突变体对HepG2细胞内的蛋白酶体基本没有抑制作用,但是它们都保留了对HepG2细胞增殖的抑制活性.这些结果揭示,作为一种特异的胰蛋白酶抑制剂,rBTI分子中的保守区域氨基酸残基虽然对胰蛋白酶的抑制作用有显著影响,但并不影响其抑制肿瘤细胞的增殖,仍能发挥其原有的生物学功能.

一种薏苡抗真菌蛋白的制备及抑菌活性研究

以薏苡(Coix chinensis)种子为实验材料,通过脱脂、水提、Resource S阳离子交换层析和Superdex 75凝胶排阻层析等步骤纯化得到一种新的抗真菌蛋白,并对其抑菌活性进行初步鉴定。SDS-PAGE分析显示该蛋白的分子质量约为28kD。抑菌活性鉴定表明,该蛋白对链格孢霉(Alternaria alternate)、绿色木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus)3株丝状真菌具有显著的生长抑制活性,并呈现出剂量依赖的特征。本研究建立分离薏苡28kD抗真菌蛋白的方法,制备方法简单易行,所得产品纯度达到95%以上。

苦荞种子总黄酮提取方法的比较研究

目的比较不同方法提取苦荞种子总黄酮的效果。方法分别用乙醇回流提取法、微波辅助提取法、超声波提取法、碱水浸提法及热水浸提法提取苦荞种子总黄酮,用高效液相色谱法测定总黄酮含量,计算提取产率。结果乙醇回流提取法提取总黄酮产率最高,微波和超声波提取法次之,碱水和热水浸提法最低。结论微波提取法具有明显的高效性,适于大量提取苦荞种子总黄酮。

超声造影与超声弹性成像对浅表淋巴结鉴别诊断的研究

引起淋巴结肿大的原因很多,如全身性及局部感染、结核、淋巴瘤以及其他器官恶性肿瘤的转移,如乳腺癌、甲状腺癌等恶性肿瘤的淋巴结转移。淋巴结良恶性的准确判断,对判定疾病的良恶性、诊疗计划的制定、判定恶性肿瘤的分期和预后非常重要。但是,目前定性淋巴结的金标准依然是病理学诊断,然而,并非所有的淋巴结都适合活检,特别是体积小、位置深、靠近血管的淋巴结,无论对其进行穿刺活检或是手术活检,难度都较大。

苦荞过敏蛋白全长基因的克隆、表达及免疫学活性研究

养麦属于一种常见的植物性过敏原。本实验在以往研究的基础上,以苦荞种子总RNA为模板,通过RT- PCR和5'-RACE等方法,扩增、克隆获得苦荞过敏蛋白全长cDNA序列。分析表明,该序列编码一个南515个氨基酸残基组成的功能蛋白,并与甜荞过敏性贮藏蛋白的氨基酸序列同源性达到90%以上。经原核表达及一步亲和纯化后得到纯度较高的重组苦荞过敏蛋白(rTBt)。采用竞争性ELISA对其免疫活性分析显示,目的蛋白与荞麦过敏病人血清中的IgE抗体可以特异结合。

绒毛香茶菜精油化学成分的GC-MS分析及其抑菌活性鉴定

用水蒸气蒸馏法提取绒毛香茶菜叶精油,并用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对其化学成分进行分析。共鉴定出31种化合物,主要含有脂肪族烯烃、醇类、酯类、脂肪族烷烃、芳香烃等化合物。用峰面积归一法测定了各成分的相对质量分数,约占精油总组分的92.94%,含量最高的单一化合物为柠檬烯,占总量的36.86%。利用平板涂布法测定了该精油对四种供试菌株的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC),结果显示,该精油对阪崎肠杆菌没有明显抑制作用,但对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌都有较强的抑制效果。其中,对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,MIC和MBC分别为1μL/m L和5μL/m L。

荧光双分子互补分析Ezrin与L-periaxin的互作模式

腓骨肌萎缩症4F亚型是Periaxin基因的突变所导致一种脱髓鞘型遗传病.Periaxin蛋白是外周神经系统中特异且大量表达的蛋白,在髓鞘成熟与维护中发挥重要作用.而Ezrin是一种膜骨架连接蛋白,在细胞形态的维持、运动、黏附等方面发挥重要作用.在前期已证实L-periaxin与Ezrin间存在蛋白互作的基础上,本文通过分子荧光互补实验,结合免疫荧光定位实验、免疫共沉淀等技术,进一步分析并揭示了L-periaxin蛋白与Ezrin蛋白之间的互作方式,具体为L-periaxin(1-200 aa)与Ezrin(1-296 aa)以及L-periaxin(1060-1461 aa)与Ezrin(475-585 aa)以"头对头"与"尾对尾"的方式发生相互作用.Ezrin可能是一种引导L-periaxin在施万细胞膜上堆积的新的分子配体,二者可能通过蛋白分子间更加紧密的方式完成在细胞膜处的堆积,参与到髓鞘的维护中.

麦麸结合态多酚对肝癌HepG-2细胞增殖及凋亡效应研究

以小麦麸皮为原材料,采用丙酮-碱消化法,获得麦麸中的多酚物质,结合态多酚(WBBP)和自由态多酚(WBFP),研究WBBP对肝癌HepG-2细胞增殖和凋亡的影响。结果表明,麦麸结合态多酚的得率和含量均高于自由态多酚,WBBP处理对肝癌HepG-2细胞增殖的抑制效应具有浓度依赖性,而且不同浓度的WBBP通过诱导HepG-2肝癌细胞周期在S期阻滞,显著抑制了细胞增殖,凋亡以及线粒体膜电位的结果显示,随着WBBP处理浓度的增加,HepG-2肝癌细胞的凋亡、线粒体膜电位下降的细胞比例显著(P<0.01)增加,Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的酶活性也显著(P<0.01)增加,结果显示,WBBP通过Caspase依赖的线粒体凋亡路径诱导HepG-2肝癌细胞凋亡,显著抑制其增殖发挥抗肝癌效应。

苦荞过敏原TBa和TBb基因的共表达及其包涵体复性的研究

【研究目的】利用大肠杆菌共表达苦荞过敏蛋白的两个亚基,并对表达产物进行包涵体复性研究和免疫学活性分析;【方法】用已构建的表达质粒pET-28a-TBa和pET-32m-TBb,共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,利用双抗生素筛选法,获得稳定遗传的双质粒转化子,经IPTG诱导,两个基因在同一宿主菌中共表达,在共表达产物复性过程中,两个亚基互为分子伴侣,相互促进了蛋白质的重新正确折叠;【结果】表达蛋白以包涵体的形式存在,ELISA检测表明:复性后的蛋白免疫学活性得到了提高;【结论】由此获得了有活性的蛋白质,并且建立了不相容双质粒共表达外源基因和包涵体复性的方法。

苦荞α-螺旋发夹抗菌肽的分子改造抑制植物真菌活性

本研究对来源于苦荞的α-螺旋发夹抗菌肽Ft AMP抗真菌机制与结构之间的关系进行了研究。首先人工合成了Ft AMP分子中N-端和C-端的α-螺旋(Ft AMP-N和Ft AMP-C),探究两个α-螺旋究竟是哪个螺旋在起抗菌作用。然后以Ft AMP为模板,α-螺旋区电荷和两亲性特征为变化要素,利用螺旋轮投影和特定氨基酸残基替换的方法,对其进行初步分子改造,并通过对多肽结构和活性比较,探讨Ft AMP结构-功能的关系。研究表明,Ft AMP-N和Ft AMP-C都显示出良好的抗菌活性。根据螺旋轮投影方法分析螺旋的两亲性特征,并以Ft AMP氨基酸序列为模板,分别表达4个Ft AMP突变体(Ft AMP-E12A、Ft AMP-E12A/E9K、Ft AMP-E12A/E9A和Ft AMP-E12A/E9K/T24E)。圆二色光谱分析显示,4个多肽都可正确折叠成α-螺旋结构,在208 nm和222 nm处有典型的双负峰,表明氨基酸的改变及其表达过程中并未改变多肽的二级结构。抗真菌活性分析显示,与Ft AMP相比,4种突变体对植物真菌的抑制作用均有一定增强。特别是Ft AMP-E12A/E9K突变体,其抗真菌作用增强约1倍,同时诱导溶血活性并不显著,选择特异性提高近2倍。该研究也进一步表明,α-螺旋发夹抗菌肽发挥抗真菌效应主要与其螺旋结构有关,而与其抑制剂的活性位点没有关系,为该类抗菌肽结构和功能的关系提供了一定的参考。

八肋游仆虫中无义介导的mRNA降解途径因子的细胞共定位研究

无义介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是一种mRNA质量监控机制,识别和降解含有提前终止密码子(premature termination codons, PTCs)的异常转录本,以保障基因的准确表达。到目前为止,有报道的从高等哺乳动物到果蝇、线虫、酵母和原生动物中,均有NMD调控途径,但其机制模型存在一定的差异。由于原生动物在生物的起源与进化上的特殊地位,以及所含的调控因子相对简单,在各种分子机制的研究领域成为热点材料。本文以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)作为研究对象,从八肋游仆虫大核基因组数据库中,经过同源序列比对,分析鉴定到参与NMD途径的相关因子,包括无义mRNA识别因子poly(A)结合蛋白(poly(A) binding protein, PABP);启动NMD途径的核心因子上游移码蛋白1(up-frameshift 1, UPF1)和上游移码蛋白2(up-frameshift 2, UPF2);外显子连接复合体(exon junction complex, EJC)组分因子MAGO(Mago nashi)、Y14(Tsunagi或RMB8)、eIF4AIII(eukaryotic initiation factor 4A3)和UAP56(U2AF56 associated protein 56);降解无义mRNA的相关因子外切体(exosome)、脱帽酶(decapping mRNA 2, DCP2)、外切酶(5′-3′exoribonuclease 1, XRN1)和去腺苷酸化酶(PGK promoter directed over production, POP2)。其中,后3种蛋白质是mRNA加工小体(processing body, P-Body)的组分。通过荧光共定位分析,分别依次证实UPF1与UPF2之间、EJC组分因子之间和P-body组分因子之间的相互作用关系。随后,通过UPF2分别与MAGO和Y14的荧光共定位结果,推测八肋游仆虫依赖于EJC的NMD途径模型。通过UPF1分别与DCP2和外切体(exosome)的荧光共定位结果,推测了八肋游仆虫无义mRNA的两种降解方式:一种是无义mRNA被介导到P-body中分别被DCP2和POP2脱去5′端帽和3′端Poly(A)尾,随后在XRN1的作用下,沿着5′→3′的方向降解;另一种是在胞质中,无义mRNA直接通过招募POP2去腺苷酸化,随后又在招募来的外切体作用下,沿着3′→5′的方向降解。

人工纤维小体骨架蛋白的分子设计与自组装

纤维小体是厌氧微生物分泌的能够高效降解木质纤维素的一种多酶复合体。其骨架蛋白质的大量重组合成是人工纤维小体构建的关键。为了构建全长的结构复杂的能招募大量酶亚基的骨架蛋白质,本研究对解纤维梭菌Ruminiclostridum cellulolyticum骨架蛋白CipC进行分子模块化设计,并分别与肽-蛋白质共价偶联系统SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher融合表达。然后分别通过非固定化和固定化组装策略对人工纤维小体骨架蛋白质进行了初步组装。结果显示,SpyTag和SpyCatcher、SnoopTag和SnoopCatcher之间自发形成稳定的共价异肽键,而且SpyTag和SnoopCatcher,SnoopTag和SpyCacther之间无交叉反应。最终成功组装出含有不同数量黏附域的骨架蛋白质,实现骨架蛋白链的延伸。本研究为构建结构更复杂、活性更高的人工纤维小体提供了新的设计思路并奠定了其技术基础。

苦荞麦主要过敏蛋白N端基因片段的克隆及序列分析

为了获得苦荞麦主要过敏蛋白全长基因并深入开展苦荞过敏蛋白的研究,本实验在先前获得的苦荞麦主要过敏蛋白C端(TBa)基因序列的基础上,设计不同的引物,以开花20d左右的苦荞麦果实为材料提取总RNA,并以此RNA为模板,通过RT-PCR和5'-RACE等方法,扩增,克隆获得苦荞麦主要过敏蛋白N端(命名为TBb)cDNA序列。序列分析结果表明,该序列由1005bp组成,开放阅读框为960bp,可编码一个由320个氨基酸残基组成的功能蛋白。同源性分析显示,此核苷酸序列与甜荞麦过敏性贮藏蛋白及豆球类蛋白的同源性达到90%。由此核苷酸序列推导出的氨基酸序列与甜荞麦13S贮藏蛋白有84%的同源性,与甜荞麦主要过敏蛋白有76%的同源性。苦荞麦主要过敏蛋白N端基因的获得为该蛋白的重组表达及其生物学活性等研究建立了前期基础。

苦荞多糖抗氧化及对Hep G2细胞增殖抑制作用

采用热提取和Superdex G75分子排阻层析对苦荞多糖进行了提取及初步的分离纯化,通过紫外光谱扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法鉴定多糖的纯度;纯化的苦荞多糖在体外检测其抗氧化能力及对Hep G2细胞增殖抑制作用。结果表明,制备的多糖纯度较高,不含核酸和蛋白质。用纯化的苦荞多糖在体外检测其抗氧化能力及其对Hep G2细胞增殖和细胞核的影响。结果表明,该多糖对羟基自由基有明显的清除作用,清除作用与浓度有一定的量效关系,EC_(50)为0.17 mg/m L,对Hep G2细胞增殖有明显的抑制作用,并可使细胞核形态出现聚缩,染色质DNA出现断裂。苦荞多糖的制备及其体外抑制肿瘤细胞的增殖等初步研究为深入考察其生物学活性奠定了基础。

一种苦荞抗真菌肽的纯化及抑菌活性分析

以苦荞种子为材料,经提取、热处理,ResourceS阳离子交换层析及Superdex Peptide分子筛层析,纯化具有抗真菌活性的多肽。Tricine-SDS-PAGE分析表明,该多肽的表观分子质量约为8.0kD。表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF)显示其实际分子质量为3.909kD。该抗菌肽对白腐菌(Panus conchatus)、绿色木霉(Trichoderma reesei)和链格孢霉(Alternaria alternata)均表现出显著的生长抑制活性。绿色木霉的形态学分析显示:受到苦荞抗真菌肽影响的菌丝生长停滞,分支加剧,基内菌丝端部膨大,原生质凝缩。该抗真菌肽的制备工艺简单,产品热稳定性好,抑菌作用明显。

家蝇幼虫抗弓形虫抗菌肽分离纯化

目的从家蝇幼虫血淋巴中分离纯化具有抗弓形虫作用的抗菌肽。方法通过损伤加感染的方法诱导家蝇幼虫大量表达抗菌肽,然后经过研磨、离心和层析等过程,将家蝇幼虫抗菌肽进行分离纯化,采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法和血细胞计数法筛选对弓形虫速殖子有抑制作用的抗菌肽。结果经Resource S阳离子柱和Su-perdex G75凝胶柱层析后,筛选出2种对弓形虫速殖子有杀伤作用的抗菌肽。结论家蝇幼虫血淋巴中存在抗弓形虫作用的抗菌肽,而且不止一种,但其效果有所不同。