稳定敲低NLRP3基因的小鼠巨噬细胞系的建立与鉴定

目的:建立NLRP3炎性体缺损的小鼠巨噬细胞模型。方法:构建靶向NLRP3基因的带GFP和Neo标记的shRNA表达载体,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7后用G418抗性标记筛选稳定转染的细胞克隆,并利用GFP标记通过流式细胞仪进一步纯化,得到的细胞命名为RAWNKD。利用定量PCR检测RAWNKD细胞及其在LPS和ATP联合刺激下NLRP3基因的稳定抑制效果。结果:RAWNKD细胞GFP标记的阳性率在80%以上,NLRP3基因的抑制率超过90%,即使用LPS和ATP联合刺激NLRP3基因mRNA增加也不明显。结论:成功建立了NLRP3基因稳定敲低的小鼠巨噬细胞系,这种NLRP3炎性体缺损的巨噬细胞是探究NLRP3炎性体活化途径及其介导的炎症信号转导的有力工具。

汉黄芩素对LPS和ATP联合诱导的巨噬细胞炎症反应的抑制作用

目的:探究汉黄芩素对巨噬细胞炎症反应的抑制作用。方法:设正常对照组,LPS和ATP联合刺激组(LPS刺激4 h后加ATP刺激30 min),汉黄芩素干预组(刺激的同时加入汉黄芩素)。利用免疫荧光法观察各组细胞NF-κB的核定位,荧光定量PCR法检测各组细胞IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3及Caspase-1的mRNA水平,流式细胞术检测各组细胞活性氧(ROS)水平,酶联免疫吸附法检测胞外IL-6和TNF-α水平。结果:与LPS和ATP刺激组相比,汉黄芩素干预组细胞胞内NF-κB核定位明显减少,胞内IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3和Caspase-1的mRNA,胞内ROS及胞外IL-6和TNF-α水平都显著降低(P<0. 01)。结论:汉黄芩素可能通过减少巨噬细胞ROS的产生,降低NF-κB的核定位,进而弱化NF-κB调控的炎症相关分子的基因转录来干预巨噬细胞的炎症反应。

汉黄芩素对LPS-ATP诱导的巨噬细胞氧化应激的抑制作用

目的:探究汉黄芩素对巨噬细胞炎症反应中氧化应激的抑制作用。方法:将巨噬细胞RAW264.7分为对照组(正常培养不予刺激),模型组(LPS和ATP联合刺激,LPS刺激4 h后加入ATP刺激30 min),汉黄芩素干预组(同样予以LPS和ATP联合刺激,LPS刺激的同时加入汉黄芩素)。检测试剂盒检测SOD、NO、MDA分泌水平,免疫荧光检测各组细胞Nrf2的核转位情况,RT-qPCR检测Nrf2和抗氧化酶mRNA转录水平。结果:与模型组相比,汉黄芩素可减少LPS-ATP联合刺激的巨噬细胞MDA、NO分泌水平,上调Nrf2 mRNA的表达并促进胞浆内Nrf2的核转位,上调胞内抗氧化酶HO-1、SOD、GPx、CAT及NQO-1 mRNA的转录,增加SOD的活性。结论:汉黄芩素对LPS-ATP诱导的巨噬细胞氧化应激具有抑制作用,可能是通过抑制氧化应激来下调ROS水平,起到减轻炎症反应的作用。

犀角地黄汤合银翘散影响PKC-SSeCKS介导的F-actin变构抑制流感病毒诱导的PMVEC通透性增加

目的:基于蛋白激酶C(PKC)-Src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)介导的纤维形肌动蛋白(F-actin)变构观察犀角地黄汤合银翘散(XDY)对流感病毒诱导的肺微血管内皮细胞(PMVEC)通透性变化的影响,探讨XDY治疗病毒性肺炎的机制。方法:原代培养大鼠PMVEC,测流感病毒FM1半数组织培养感染剂量(TCID50),分组为对照组、模型组(100TCID50 FM1)和XDY组(100TCID50 FM1+XDY含药血清),不同因素干预24 h后检测跨PMVEC电阻(TER)、 PKC活性、SSeCKS mRNA和蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜观察SSeCKS定位和F-actin结构变化。结果:流感病毒感染导致PMVEC的TER降低(通透性增强)、PKC活性增高,XDY可增高TER、降低PKC活性;XDY可下调流感病毒诱导升高的SSeCKS mRNA和蛋白表达,并使集中分布在核周的SSeCKS趋于均匀分布在细胞中;模型组细胞周边F-actin致密束基本消失,XDY可明显改善这种变构。结论:犀角地黄汤合银翘散可以抑制PKC-SSeCKS通路激活并影响F-actin的变构从而干预流感病毒诱导的PMVEC通透性增高。

小檗碱通过mtROS-NLRP3通路抑制H_(2)O_(2)诱导的巨噬细胞焦亡

目的:探究小檗碱(BBR)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的巨噬细胞焦亡的影响及mtROS-NLRP3通路在其中的调控作用。方法:以巨噬细胞J774A.1为研究对象,设置正常对照组(control组)、模型组(H_(2)O_(2)作用24 h)、BBR干预组(H_(2)O_(2)+BBR作用24 h)和ROS清除剂NAC干预组(H_(2)O_(2)+NAC作用24 h)。流式细胞术检测各组细胞活性氧簇(ROS)的生成,免疫荧光检测ROS与线粒体的共定位情况,实时荧光定量PCR检测各组细胞NLRP3、IL-1β的基因转录水平,Western blot检测NLRP3蛋白表达量,流式细胞术检测caspase-1的活化及其介导的细胞焦亡率,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组细胞LDH的释放量,ELISA检测IL-1β分泌水平。结果:与模型组相比,BBR干预后显著减少了H_(2)O_(2)诱导的巨噬细胞线粒体ROS(mtROS)的生成,下调了NLRP3和IL-1β的基因表达水平,减少了NLRP3蛋白的表达,降低了caspase-1活化水平及其介导的细胞焦亡率,同时减少了细胞上清液中LDH和IL-1β的释放。结论:小檗碱可能通过下调mtROS水平进而抑制NLRP3炎症体介导的细胞焦亡以减轻炎症反应。

犀角地黄汤合银翘散通过干预mtROS-NLRP3通路抑制流感病毒感染的巨噬细胞焦亡

目的:探究犀角地黄汤合银翘散(XDY)对流感病毒引起的炎症反应中巨噬细胞焦亡的作用及其机制。方法:将巨噬细胞J774A.1分为正常对照组(正常培养)、模型组(流感病毒PR8感染24 h)、XDY组(PR8感染+XDY作用24 h)、H2O2对照组(H2O2作用24 h)和H2O2+XDY组(H2O2+XDY作用24 h)。用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组细胞LDH的释放量,流式细胞术检测由caspase-1介导的细胞焦亡率,Western blot检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)和gasdermin D N端片段(GSDMD-N)蛋白表达量,ELISA检测白细胞介素1β(IL-1β)分泌水平,激光共聚焦显微镜观察活性氧簇(ROS)与线粒体的共定位和释放情况。结果:流感病毒感染及H2O2作用后,巨噬细胞LDH释放和GSDMD-N蛋白表达增多,caspase-1介导的细胞焦亡率升高,同时NLRP3蛋白表达、IL-1β分泌和线粒体ROS(mtROS)生成亦增多;与模型组和H2O2对照组相比,XDY可显著减少mtROS生成、NLRP3和GSDMD-N蛋白表达及IL-1β和LDH分泌,降低caspase-1介导的细胞焦亡率。结论:犀角地黄汤合银翘散通过干预mtROS-NLRP3炎症小体通路抑制巨噬细胞焦亡,这可能是其抗流感病毒引起的过度炎症反应的机制之一。

犀角地黄汤合银翘散通过促进流感病毒感染的小鼠巨噬细胞自噬而降低线粒体ROS水平

目的:探究犀角地黄汤合银翘散(XDY)对自噬调节的流感病毒感染小鼠巨噬细胞线粒体活性氧(mtROS)水平的影响。方法:以流感病毒PR8感染小鼠巨噬细胞J774A.1为模型,进行下列实验:(1)分为正常组、模型组(PR8感染24 h)、XDY干预组(PR8感染及162.5 mg/L XDY干预24 h)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预组(5 mmol/L 3-MA预处理3 h+PR8感染24 h)、3-MA对照组(5 mmol/L 3-MA预处理3 h再继续培养24 h)和PR8+3-MA+XDY组(5 mmol/L 3-MA预处理3 h+PR8感染及162.5 mg/L XDY干预24 h),Western blot法检测细胞微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)和P62蛋白水平,ELISA检测细胞培养上清液白细胞介素1β(IL-1β)的分泌水平;(2)分为正常组、模型组和XDY干预组,免疫荧光观察细胞线粒体膜电位、自噬体与线粒体共定位;(3)分为正常组、模型组、XDY干预组、Mito-TEMPO干预组(PR8感染及500μmol/L Mito-TEMPO干预24 h)、Mito-TEMPO对照组(500μmol/L Mito-TEMPO干预24 h)、3-MA干预组、3-MA对照组和PR8+3-MA+XDY组,流式细胞术检测mtROS水平。结果:流感病毒感染后,J774A.1细胞内LC3-II和P62蛋白水平显著升高,线粒体膜电位下降,mtROS生成增多,IL-1β分泌显著增多;与模型组相比,XDY可降低P62的表达,促进线粒体自噬,升高线粒体膜电位,减少mtROS产生及IL-1β分泌;以3-MA抑制细胞自噬可加重mtROS累积,XDY降低mtROS的作用也受到抑制。结论:XDY可通过促进流感病毒感染的小鼠巨噬细胞自噬而降低mtROS水平,从而抑制炎症反应。

犀角地黄汤合银翘散干预流行性感冒病毒感染的巨噬细胞炎症机制的网络药理学预测及实验验证

目的探究犀角地黄汤合银翘散(XDY)干预流行性感冒病毒(简称“流感病毒”)感染的巨噬细胞炎症的分子机制。方法通过GEO数据库公开发表的基因芯片筛选流感病毒PR8感染人巨噬细胞的相关基因;将XDY的活性成分与流感病毒PR8感染人巨噬细胞的相关差异基因的交集输入STRING数据库,获得靶点蛋白相互作用关系,根据蛋白相互作用密切度得到核心靶点,使用Cytoscape3.7.2软件可视化蛋白-蛋白互作网络,对该网络进行拓扑学分析;使用Metascape数据库对靶点分别进行通路富集分析。将巨噬细胞J774A.1分为正常组(正常培养)、模型组(流感病毒PR8感染)、犀角地黄汤合银翘散组(流感病毒PR8感染+XDY 162.5 mg/L),干预24 h。实时荧光PCR检测细胞中Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、肿瘤坏死因子受体相关分子6(TRAF6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)mRNA水平;免疫荧光检测核转录因子-κB(NF-κB)核转位情况;酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞上清液中TNF-α和IL-6水平。结果XDY与流感病毒PR8感染人巨噬细胞的差异基因取交集后得到104个共同靶点,通路富集分析结果显示,XDY治疗流感涉及TLR4/NF-κB通路;实时荧光PCR检测结果显示,与模型组比较,犀角地黄汤合银翘散组巨噬细胞的TLR4、MyD88、TRAF6、TNF-α和IL-6 mRNA表达水平降低(P<0.01)。免疫荧光显示,与模型组相比,犀角地黄汤合银翘散组巨噬细胞胞内NF-κB与细胞核共定位现象减少,核质比降低(P<0.01)。ELISA检测结果显示,与模型组比较,犀角地黄汤合银翘散组细胞上清液中TNF-α和IL-6水平均降低(P<0.01)。结论犀角地黄汤合银翘散可通过调节TLR4/NF-κB通路减轻流感病毒感染巨噬细胞的炎症反应。

犀角地黄汤合银翘散及其单方对小鼠流感病毒性肺炎治疗作用的比较

目的比较截断疗法经典方犀角地黄汤合银翘散及其单方对小鼠流感病毒性肺炎的治疗作用,探究犀角地黄汤和银翘散在截断疗法中的不同作用。方法ICR小鼠和BALB/c小鼠,随机分为正常组、模型组、犀角地黄汤合银翘散组(简称合方组)、犀角地黄汤组、银翘散组、达菲组,除正常组外其余小鼠以流感病毒滴鼻感染,1 h后给药。各组分别以对应的水煎剂或溶液灌胃,每日1次,连续6 d。ICR小鼠观察14 d,记录小鼠体重及生存时间;BALB/c小鼠分别在感染后第2、4、6天取材,光镜下观察肺组织病理切片、RT-PCR法检测肺组织中甲型流感病毒核蛋白(IAV-NP)mRNA水平、ELISA法检测肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平。结果合方组可提高感染小鼠生存率,延长生存时间,推后死亡极期,效果优于犀角地黄汤组和银翘散组,而犀角地黄汤组优于银翘散组;合方组在第6天可减轻感染小鼠肺组织炎性病理改变,效果优于犀角地黄汤组和银翘散组,犀角地黄汤组比银翘散组病变轻。在第2、4、6天,银翘散组IAV-NP mRNA表达降低,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01),且在第4、6天,银翘散组IAV-NP mRNA表达低于合方组(P<0.01);第4、6天,犀角地黄汤组IAV-NP mRNA表达与模型组比较,差异无统计学意义。在第4、6天,合方组、犀角地黄汤组和银翘散组肺组织TNF-α和IL-6水平低于模型组(P<0.05、P<0.01),合方组肺组织TNF-α和IL-6水平低于犀角地黄汤组和银翘散组(P<0.05、P<0.01)。犀角地黄汤组第6天TNF-α水平低于银翘散组(P<0.05),而其第2、4天IL-6水平低于银翘散组(P<0.01)。结论银翘散以抗病毒作用为主,而犀角地黄汤以抗炎作用为主,两方合用可在病毒感染早期截断病邪深入,又在疾病极期扭转严重炎症,以达到治疗效果。