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细胞与基因治疗行业发展的国内外差异—基于投融资并购及临床项目视角 被引量:2
1
作者 董文政 《中国医药导刊》 2023年第1期13-20,共8页
目的:旨在探讨国内外细胞与基因治疗行业发展的特征、状态、模式及发展趋势方面的差异,探讨国内细胞与基因治疗行业发展过程中存在的不足以及未来需要着力解决的问题和相关对策。方法:按照融资(含并购、合作)-投资-临床项目的转化逻辑,... 目的:旨在探讨国内外细胞与基因治疗行业发展的特征、状态、模式及发展趋势方面的差异,探讨国内细胞与基因治疗行业发展过程中存在的不足以及未来需要着力解决的问题和相关对策。方法:按照融资(含并购、合作)-投资-临床项目的转化逻辑,选取2018—2022年各年度行业投融资并购纵向数据及目前临床项目的进展时点数据作为样本数据,进行细胞与基因治疗行业趋势分析和结构分析。结果和结论:国内外细胞与基因治疗行业发展在规模、增长方式及其结构、行业成熟度、市场逻辑、技术应用领域、治疗方式及其技术特点、临床适应证等方面差异显著。以美国为代表的国外细胞与基因治疗的商业成熟度已经达到较高水平,行业正处于快速成长期;其投融资并购集中体现为以先进基因治疗创新技术为驱动的商业逻辑,大量的罕见病基因治疗管线研发构成了细胞与基因治疗行业的金字塔底座;在临床项目中,以AAV为主的病毒载体体内基因治疗占据较高的比重。与之相较,国内细胞与基因治疗的商业成熟度较低,整体上处于成长的早期阶段,总体规模尚小,但发展速度很快;投融资并购集中体现为宽基市场应用和追求热点的市场导向逻辑,浮躁性、盲目性和跟随性比较突出;重产能、轻研发,上下游投融资配置不佳;在临床项目中,适应证分布不合理,针对恶性肿瘤的体外细胞基因治疗占绝对份额,且原创技术较低。但是,在层出不穷、大量的未被满足的临床需求面前,我国细胞与基因治疗后续将有巨大的发展空间,只要政策合理、引导得力,以先进基因治疗技术创新为特征的中国式细胞与基因治疗行业有可能再次加速中国制造业的崛起。 展开更多
关键词 细胞与基因治疗 行业发展 国内外 投融资并购 临床项目
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双萤光素酶共表达载体构建及特性研究 被引量:4
2
作者 付昕阳 王刚 +4 位作者 田文洪 陈素云 董小岩 吴小兵 谭万龙 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期276-282,共7页
利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2... 利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc。将重组质粒瞬时转染BHK-21细胞,24h后在细胞上清液和细胞裂解液中均能检测到Gluc和Fluc的表达,其中Gluc98%以上分布在上清液中,而Fluc98%以上存在于细胞中,随时间延长Gluc活性在上清液中逐步增加,而细胞内Fluc活性则保持相对平稳。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒DNA,通过尾静脉微量采血(2.5μl/次)即可实时地监测体内Gluc的表达情况。活体成像结果显示,注射Gluc的底物腔肠素时小鼠明显表现为全身显像,显像在10min内迅速衰减;而注射Fluc的底物D-Luciferin时显像主要集中在肝脏,显像在30min内都比较稳定。本研究设计和构建的pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒实现了分泌型和非分泌型萤光素酶的共表达,既可以在不裂解细胞或处死动物的情况下直接在细胞培养上清或血液中动态检测Gluc的活性,又可以利用活体成像技术准确定位Fluc表达部位,比单一的萤光素酶报告载体在细胞标记和体内示踪研究方面更具优越性。 展开更多
关键词 Gaussia萤光素酶 萤火虫萤光素酶 TaV2A 水动力注射 共表达
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用rAAV8-1.3HBV制备两种品系小鼠乙型肝炎病毒感染模型的比较研究 被引量:3
3
作者 王刚 董小岩 +7 位作者 田文洪 尉迟捷 郑刚 高杰 王国婧 魏国超 周育森 吴小兵 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期541-547,共7页
我们先前用rAAV8-1.3HBV静脉注射C57BL/6小鼠成功地制备了慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染模型。为了探讨不同品系的小鼠对rAAV8-1.3HBV静脉注射是否具有不同反应,本研究比较了C57BL/6和BALB/c小鼠静脉注射重组病毒后外周... 我们先前用rAAV8-1.3HBV静脉注射C57BL/6小鼠成功地制备了慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染模型。为了探讨不同品系的小鼠对rAAV8-1.3HBV静脉注射是否具有不同反应,本研究比较了C57BL/6和BALB/c小鼠静脉注射重组病毒后外周血中HBV抗原和抗体水平、病毒载量和肝脏组织HBcAg表达情况,以及不同剂量重组病毒注射与这些指标的关系。将低(4×109 Viral genome,vg)、中(4×1010vg)和高(4×1011vg)三种剂量的rAAV8-1.3HBV通过尾静脉注射至C57BL/6和BALB/c小鼠,分别利用ELISA和荧光定量PCR方法检测血清中的HBV抗原、抗体水平以及HBV DNA,利用免疫组化检测肝脏组织HBcAg的表达。结果发现,对于C57BL/6小鼠,三种不同剂量rAAV8-1.3HBV注射均可造成100%小鼠出现HBV持续感染;血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA以及肝组织HBcAg稳定表达超过8个月,其表达水平随重组病毒注射剂量的增加而升高,高剂量注射时可造成超过40%的肝细胞感染HBV,血清中HBV DNA可达105 IU/mL以上;未检测到针对HBV的抗体。对于BALB/c小鼠,三种不同剂量rAAV8-1.3HBV注射也可造成100%小鼠出现HBV持续感染;血清HBeAg和HBV DNA以及肝组织HBcAg稳定表达超过8个月,但是血清HBsAg在重组病毒注射2周之后显著下降甚至消失;在中剂量注射组的BALB/c小鼠血清中检测到低水平的Anti-HBs;血清HBeAg和肝组织HBcAg的表达水平随重组病毒注射剂量的增加而增高,并且各剂量组表达水平均高于C57BL/6小鼠,高剂量注射时可造成超过50%的肝细胞感染HBV。本研究表明,低至4×109 vg剂量的rAAV8-1.3HBV注射即可造成C57BL/6和BALB/c两种品系小鼠出现HBV持续感染,并且HBV复制水平随重组病毒注射剂量增加而增高;BALB/c小鼠对HBV的免疫反应强于C57BL/6小鼠,可以产生针对HBsAg的体液免疫反应而使血清HBsAg转阴,但无法清除携带HBV的肝细胞。 展开更多
关键词 动物模型 乙型肝炎病毒 重组8型腺相关病毒 小鼠品系
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抗AAV2单克隆抗体的制备及特性研究
4
作者 谭淑萍 袁振华 +2 位作者 田文洪 董小岩 吴小兵 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期267-273,共7页
以纯化的重组AAV2病毒颗粒为抗原免疫小鼠,获得7株稳定分泌抗AAV2衣壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中B10和G4两株单克隆抗体具有中和活性,抗体亚型分别为IgG1和IgG2a型。对这两株单克隆抗体与rAAV病毒结合的特性进行了研究。单克隆... 以纯化的重组AAV2病毒颗粒为抗原免疫小鼠,获得7株稳定分泌抗AAV2衣壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中B10和G4两株单克隆抗体具有中和活性,抗体亚型分别为IgG1和IgG2a型。对这两株单克隆抗体与rAAV病毒结合的特性进行了研究。单克隆抗体B10和G4对rAAV2病毒颗粒的结合均具有良好的血清型特异性,并且这种特异结合作用不被肝素阻断。这两株抗体都不阻断AAV2病毒与敏感细胞的结合,提示它们与病毒颗粒的结合位点都不处于AAV2病毒与主要受体结合的部位内。Western blotting检测结果显示,B10与AAV2的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3均能结合,而G4不能与AAV2的这三种衣壳蛋白结合。这说明B10与AAV2结合的位点位于衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠部分处并且可能是线性表位,而G4则可能是针对AAV2病毒颗粒构象表位的抗体。这两种结合特性不同的单克隆抗体为研究AAV2病毒颗粒的表面特性和感染特性提供有用的工具。 展开更多
关键词 2型腺相关病毒 单克隆抗体 中和抗体 构象表位
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用重组8型腺相关病毒载体介导的乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型评价核苷类似物的抗病毒效果 被引量:11
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作者 王国婧 王刚 +5 位作者 董小岩 田文洪 尉迟捷 魏国超 孟红 吴小兵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期95-106,共12页
探索用重组8型腺相关病毒载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒(rAAV8-1.3HBV)介导的HBV持续感染小鼠模型评价核苷酸类似物抗病毒药物的抗病毒效果。首先,通过将rAAV8-1.3HBV经尾静脉注射到30只C57BL/6小鼠体内,建立HBV持续感染模型并对模型成... 探索用重组8型腺相关病毒载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒(rAAV8-1.3HBV)介导的HBV持续感染小鼠模型评价核苷酸类似物抗病毒药物的抗病毒效果。首先,通过将rAAV8-1.3HBV经尾静脉注射到30只C57BL/6小鼠体内,建立HBV持续感染模型并对模型成功率进行检测,将建模成功的27只小鼠随机分成6组。然后采取灌胃的方式给予不同剂量的抗病毒药物恩替卡韦(ETV)及拉米夫定(LAM),每日1次,连续10 d,后停药15 d,同时设置生理盐水及空白对照组。其中ETV分为高剂量(1.0 mg/(kg d))和低剂量(0.1 mg/(kg d))两组;LAM分为高剂量(500 mg/(kg d))和低剂量(100 mg/(kg d))两组。检测给药前后和停药前后小鼠模型血清中HBV DNA、HBeAg和HBsAg表达水平并比较变化情况。结果发现连续给药10 d后,各给药组与生理盐水组相比,血清中HBV DNA水平均显著下降,具有统计学差异(P<0.05)。停药15 d后,低剂量的ETV与LAM两组血清HBV DNA水平出现反弹,差异存在统计学意义(P<0.05)。在整个实验过程中,各组小鼠血清中HBeAg和HBsAg表达水平均未出现明显变化。上述结果表明,ETV和LAM能有效抑制模型小鼠中HBV病毒的复制,而对HBeAg和HBsAg表达水平无明显影响;提示AAV8-1.3HBV介导的HBV持续感染小鼠模型制备简单,成模率高,可有效体现出ETV和LAM抗HBV的作用效果,从而用于核苷酸类似物抗HBV药物的筛查。 展开更多
关键词 rAAV8-1.3HBV 乙型肝炎病毒 小鼠模型 核苷酸类似物 药物筛选 药物评价
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体外实时动态监测水动力注射分泌型荧光素酶基因的表达 被引量:6
6
作者 田文洪 王刚 +4 位作者 罗顺涛 董小岩 付昕阳 谭文杰 吴小兵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1552-1557,共6页
为了建立体外实时动态监测转导基因的体内表达,本研究选择分泌型的荧光素酶基因Gluc作为报告基因,对其体内外表达特性和检测方法进行了研究。首先构建了Gluc表达质粒pAAV2neo-Gluc。将pAAV2neo-Gluc转染体外培养的Huh7、HepG2细胞后,细... 为了建立体外实时动态监测转导基因的体内表达,本研究选择分泌型的荧光素酶基因Gluc作为报告基因,对其体内外表达特性和检测方法进行了研究。首先构建了Gluc表达质粒pAAV2neo-Gluc。将pAAV2neo-Gluc转染体外培养的Huh7、HepG2细胞后,细胞培养上清和细胞裂解液中分别检测到Gluc的活性,而上清比细胞中的含量高约100倍。表明表达的Gluc以分泌形式为主。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neo-Gluc质粒,活体成像表明Gluc在小鼠体内呈全身分布,而注射了萤火虫荧光素酶质粒pAAV2neo-Fluc的对照小鼠则主要在肝脏显像。将剂量分别为0.1、1、10、50μg每只的pAAV2neo-GlucDNA用水动力法尾静脉注射小鼠,不同时间点连续尾静脉采血测定其中的Gluc酶活性,观察其Gluc体内表达和分泌的动态变化。结果显示,各剂量组的Gluc表达变化规律高度一致:注射后2h即可检测到Gluc表达,10h后达到高峰,之后逐渐下降;Gluc的表达水平与注射质粒DNA的量呈正相关;为了进一步观察Gluc检测的灵敏性,本研究又比较了注射更低的质粒剂量(包括0.001、0.01和0.1μg每只)时Gluc体内表达情况。结果发现注射剂量低至0.001μg每只小鼠都能在血中检测到Gluc表达,这一结果提示了Gluc检测的高度灵敏性。本研究首次报道了以Gluc为报告基因体外实时动态监测水动力注射基因的表达规律,为动态分析水动力注射基因的体内表达调控及功能研究提供了新的有效手段。 展开更多
关键词 水动力注射 基因表达 Gluc 监测 EX VIVO
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CMV与T7启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较 被引量:8
7
作者 魏国超 田文洪 +5 位作者 王刚 柳云帆 尉迟捷 董小岩 凌虹 吴小兵 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期237-245,共9页
构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader... 构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader序列以及丁型肝炎病毒核酶序列,插入含有CMV和T7双启动子的质粒pVAX1中,获得仙台微小基因组的通用型载体pVAX-miniSeV。将Gluc基因插入pVAX-miniSeV中,分别获得正向插入的仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV-Gluc(+)和反向插入的pVAX-miniSeV-Gluc(-)。用pVAX-miniSeV-Gluc(+)转染BHK21细胞能在上清中检测到高水平的Gluc活性,表明其中的CMV启动子具有正常转录功能。将pVAX-miniSeVGluc(-)和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒共转染BSR T7/5细胞(稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞)检测到Gluc的高效表达,表明pVAX-miniSeV-Gluc(-)能够被有效拯救;但在BHK-21细胞中却未检测到Gluc的有效表达,提示该载体中的CMV启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率可能没有明显作用。为了进一步了解CMV与T7启动子各自对于仙台病毒微小基因组拯救的作用,本研究又构建了单独含有CMV或T7启动子的仙台病毒微小基因组载体pCMV-miniSeV-Gluc(-)和pT7-miniSeV-Gluc(-)。将这两种载体和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒分别共转染BSR T7/5细胞,结果pT7-miniSeV-Gluc(-)共转染组检测到了Gluc的高效表达,而pCMV-miniSeV-Gluc(-)共转染组未检测到,证实了通用型载体pVAX-miniSeV中仅T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救起了关键作用,而CMV启动子作用不明显。本研究成功构建了一种通用型双启动子仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV,并证明了T7启动子系统对仙台病毒微小基因组拯救的关键作用。本研究为下一步构建仙台病毒全基因感染性克隆打下了基础。 展开更多
关键词 T7启动子 CMV启动子 仙台病毒 微小基因组
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新型重组AAV5/5载体及包装系统 被引量:3
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作者 董小岩 田文洪 +2 位作者 袁振华 谭淑萍 吴小兵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期679-686,共8页
本研究组建了一种可用于规模化生产的以重组单纯疱疹病毒为辅助病毒的AAV5/5载体包装系统。首先,将5型腺相关病毒(AAV5)的rep和cap基因插入I型单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组非必需基因UL2中,获得重组病毒rHSV1-rep5cap5。其次,构建一种携带... 本研究组建了一种可用于规模化生产的以重组单纯疱疹病毒为辅助病毒的AAV5/5载体包装系统。首先,将5型腺相关病毒(AAV5)的rep和cap基因插入I型单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组非必需基因UL2中,获得重组病毒rHSV1-rep5cap5。其次,构建一种携带AAV5ITR的通用型载体质粒pAAV5neo,将报告基因EGFP插入pAAV5neo中,得到pAAV5neo-EGFP质粒。将pAAV5neo-EGFP质粒导入BHK-21细胞,用G418选择培养,挑选出表达EGFP并在重组病毒rHSV1-rep5cap5感染下能高效产生rAAV5/5-EGFP的单克隆载体细胞株C020。用rHSV1-rep5cap5感染C020细胞制备rAAV5/5-EGFP,用"氯仿处理-聚乙二醇/氯化钠-氯仿抽提"方法粗纯化rAAV5/5-EGFP。用100kDa分子量截流超滤方法进一步纯化和浓缩,获得高纯度的rAAV5-EGFP。SDS-PAGE电泳分析可见3条特征性外壳蛋白带。电镜分析显示病毒颗粒以实心颗粒为主。用rAAV5/5-EGFP病毒按1×105vg/cell感染体外培养的HEK293细胞,可见30%细胞呈现绿色荧光。本研究提出了一种高效AAV5/5载体生产系统和纯化方法,为重组AAV5载体的进一步应用提供了基础。 展开更多
关键词 5型腺相关病毒(AAV5) I型单纯疱疹病毒(HSV1) 病毒载体 包装系统
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利用分泌型荧光素酶体外长期监测小鼠肝脏microRNA活性 被引量:4
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作者 王刚 董小岩 +4 位作者 胡键阳 田文洪 尉迟捷 王岳 吴小兵 《中国科学:生命科学》 CSCD 北大核心 2011年第4期273-280,共8页
活体动物microRNA(miRNA)检测技术对阐明miRNA的生物学功能非常重要.但是,目前缺乏一种方便灵敏的实时反映活体动物miRNA活性及其变化的体外监测手段.通过在分泌型荧光素酶Gluc(Gaussia princeps luciferase)mRNA的3′非翻译区插入相应m... 活体动物microRNA(miRNA)检测技术对阐明miRNA的生物学功能非常重要.但是,目前缺乏一种方便灵敏的实时反映活体动物miRNA活性及其变化的体外监测手段.通过在分泌型荧光素酶Gluc(Gaussia princeps luciferase)mRNA的3′非翻译区插入相应miRNA的靶序列构建一系列miRNA传感器.将miRNA传感器体外转染培养细胞和通过水动力注射方法转染小鼠肝脏,通过检测细胞培养上清和外周血液中的Gluc来反映细胞内和活体动物肝脏的miRNA活性.结果显示,CMV启动子驱动的miRNA传感器可以长期监测体外培养细胞中的miRNA和短期监测小鼠肝脏的miRNA,但由于启动子在肝脏的沉默不能用于长期监测肝脏miRNA;CAG启动子驱动的传感器则成功地实现了对肝脏内源性miR-122,miR-142和miR-34a以及对肝脏过表达的miR-34a的长期实时监测.利用以Gluc为报告基因的miRNA传感器,通过检测外周血Gluc可以方便地在体外长期连续监测小鼠肝脏的miRNA. 展开更多
关键词 microRNA传感器 分泌型Gaussia荧光素酶 体外监测
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用分泌型萤光素酶报告系统比较TTR启动子与CMV启动子的体内外表达特性 被引量:2
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作者 罗顺涛 田文洪 +3 位作者 王刚 董小岩 杨莉 吴小兵 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期424-429,共6页
GLuc(GaussiaLuciferase)是一种高灵敏度分泌型萤光素酶。本研究利用GLuc的易分泌、高灵敏性和检测方法简单快速的特点,初步比较了TTR启动子(PTTR)与CMV启动子(PCMV)的体内外表达特性。首先构建了两种启动子-报告基因表达质粒pAAV... GLuc(GaussiaLuciferase)是一种高灵敏度分泌型萤光素酶。本研究利用GLuc的易分泌、高灵敏性和检测方法简单快速的特点,初步比较了TTR启动子(PTTR)与CMV启动子(PCMV)的体内外表达特性。首先构建了两种启动子-报告基因表达质粒pAAV2-neo-TTR-GLuc和pAAV2-neo-CMV-GLuc。用脂质体转染法将它们分别转染至两株肝细胞源的细胞株Huh7与HepG2以及两株非肝细胞源细胞株HEK293与HeLaS3。在转染后不同时间点取细胞培养上清液检测GLuc的表达。此外采用水动力注射法,将这两种质粒分别以注射剂量0.1μg、1μg和10μg/只经尾静脉注射至BALB/c小鼠体内,注射后2h开始在不同时间点上经尾静脉采集全血(2.5μl/次)并测定血液中的GLuc水平。细胞实验结果显示,PCMV介导的GLuc表达都明显高于PTTR;然而,在HEK293和HeLaS3细胞中PCMV比PTTR的表达水平高50-300倍,而在Huh7和HepG2中仅高10倍以内,提示PTTR具有相对的肝细胞特异性。在小鼠实验中,PCMV介导的GLuc表达在各剂量组中也明显高于PTTR,然而它们表达水平变化特征明显不同:PCMV介导的GLuc表达在质粒注射后约10h达到最大值,此后迅速下降;而PTTR介导的GLuc表达在质粒注射后约48h达到峰值,随后缓慢下降。上述实验结果提示,PTTR虽然在表达强度方面不及PCMV但其介导的表达水平维持长时间,下降较缓慢,比较适于目的基因在肝脏内的较长时间表达。 展开更多
关键词 分泌型萤光素酶 水动力注射 启动子 转甲状腺素蛋白 巨细胞病毒
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重组8型腺相关病毒介导双荧光素酶基因在小鼠体内的表达 被引量:1
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作者 王刚 尉迟捷 +2 位作者 董小岩 田文洪 吴小兵 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2012年第6期439-441,共3页
目的利用共表达的分泌型荧光素酶Gluc(gaussiaprincepsluciferase)和非分泌型荧光素酶Fluc(fireflyluciferase)研究重组8型腺相关病毒(recombinantadeno—associatedvirustype8,rAAV8)介导的转基因在小鼠体内的表达特点。方法制... 目的利用共表达的分泌型荧光素酶Gluc(gaussiaprincepsluciferase)和非分泌型荧光素酶Fluc(fireflyluciferase)研究重组8型腺相关病毒(recombinantadeno—associatedvirustype8,rAAV8)介导的转基因在小鼠体内的表达特点。方法制备携带双荧光素酶基因的重组8型腺相关病毒rAAV8-Gluc/Fluc,体外感染HEK293细胞并检测上清和胞内Gluc和Fluc活性;将不同剂量的rAAV8-Gluc/Fluc尾静脉注射或肌内注射至BALB/c小鼠,通过尾静脉采血检测Gluc活性,通过活体成像和裂解组织检测Fluc活性。结果成功制备了rAAV8-Gluc/Fluc,可以有效感染HEK293细胞,同时分泌表达Gluc和胞内表达Fluc;尾静脉注射或肌内注射rAAV8.Gluc/Fluc至小鼠后,外周血Gluc活性均在注射后10—20d达到高峰并稳定持续120d以上,Gluc活性随注射剂量增加而增高;静脉注射rAAV8-Gluc/Fluc时Fluc主要在肝脏表达,在骨骼肌和心肌有少量表达,而肌内注射时Fluc既在肌内注射局部表达同时也在肝脏中表达。结论本研究成功制备了携带双荧光素酶基因rAAV8-Gluc/Fluc,研究了其介导的转基因在小鼠体内的表达特点,为rAAV8的临床前应用打下基础。 展开更多
关键词 依赖病毒 荧光素酶 表达的序列标记
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建立分泌型荧光素酶基因标记的原位肝癌模型及用于干扰素β基因治疗评价
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作者 王刚 连忠辉 +3 位作者 田文洪 董小岩 尉迟捷 吴小兵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1236-1244,共9页
旨在建立一种分泌型荧光素酶基因标记的小鼠原位移植型肝癌模型并观察其对干扰素β基因治疗的反应。首先建立稳定表达分泌型荧光素酶Gluc(Gaussia princeps luciferase)的小鼠肝癌细胞Hepa 1-6/Gluc;将该细胞通过脾注射至C57BL/6小鼠肝... 旨在建立一种分泌型荧光素酶基因标记的小鼠原位移植型肝癌模型并观察其对干扰素β基因治疗的反应。首先建立稳定表达分泌型荧光素酶Gluc(Gaussia princeps luciferase)的小鼠肝癌细胞Hepa 1-6/Gluc;将该细胞通过脾注射至C57BL/6小鼠肝脏建立原位移植型肝癌模型,通过检测外周血Gluc活性监测小鼠体内肿瘤生长情况;用此模型观察水动力注射干扰素β质粒DNA的抗肿瘤效果。结果表明,通过脾注射Gluc基因标记的Hepa 1-6细胞可以建立小鼠原位移植型肝癌模型;外周血Gluc活性可以有效反映体内接种肿瘤细胞的数量和肿瘤的生长情况;通过监测外周血Gluc活性可灵敏反映干扰素β基因治疗对肿瘤生长的抑制作用。本研究表明,利用Gluc为报告基因建立的小鼠原位移植型肝癌模型可以体外实时监测肿瘤的生长情况,并能灵敏可靠地用于抗肿瘤治疗效果的评价。 展开更多
关键词 荧光素酶 Gluc 肝癌模型 IFN—β 基因治疗
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基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装
13
作者 柳云帆 尉迟捷 +8 位作者 王刚 田文洪 陆月 刘雪荣 董小岩 郑刚 沈炜 吴小兵 阮力 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期257-264,共8页
本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的... 本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的线性DNA片段;将pFG140质粒及线性DNA片段依次转化到宿主菌BW25113/pIJ790中,通过λ-Red重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒pFG140-ΔⅣa2(1104)。酶切及DNA测序结果显示,用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法在pFG140上精确地缺失了预计的Ⅳa2基因3'端的1104bp片段。用PCR方法扩增获得Ⅳa2基因全长ORF,插入表达载体pAAV2neo中,构建成Ⅳa2基因表达质粒pAAV2neo-Ⅳa2。将pFG140-ΔⅣa2(1104)与pAAV2neo-Ⅳa2共转染HEK293细胞,成功地获得了重组腺病毒Ad5ΔⅣa2(1104)。Western Blot的结果表明,Ad5ΔⅣa2(1104)病毒感染的HEK293细胞检测不到Ⅳa2蛋白的表达。本研究建立了一种对腺病毒基因组直接进行缺失操作的λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法,并获得了一种IVa2基因大部分缺失的重组腺病毒。 展开更多
关键词 λ-Red重组酶 PCR打靶 腺病毒 Ⅳa2
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一种利用分泌型荧光素酶基因表达变化监测活细胞中miRNA活性的新方法
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作者 田文洪 董小岩 +1 位作者 王刚 吴小兵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期809-816,共8页
建立了一种以分泌型的荧光素酶Gluc为报告基因的miRNA传感器质粒(命名为Gsensor)监测活细胞中miRNA(microRNA)活性的方法。首先构建了pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA质粒作为Gsensor的空载体,同时其中的MCS位点可供插入miRNA的靶序列。以m... 建立了一种以分泌型的荧光素酶Gluc为报告基因的miRNA传感器质粒(命名为Gsensor)监测活细胞中miRNA(microRNA)活性的方法。首先构建了pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA质粒作为Gsensor的空载体,同时其中的MCS位点可供插入miRNA的靶序列。以miR142-3p为检测对象,将1个和3个拷贝的与miR142-3p完全互补靶序列分别插入pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA中,构建成miR142-3p Gsensor和miR142-3p Gsensor-3。将它们分别转染至U937细胞中,检测培养上清中Gluc的表达水平。结果显示二者均可有效反映U937细胞中miR142-3p的抑制活性(分别与Gsensor空载体相比),提示Gsensor中采用一个拷贝的miRNA靶序列即可满足检测要求。并且miR142-3p Gsensor也能有效地反映出Anti-miR142对miR142-3p活性的抑制作用。随后,分析了时间、转染剂量对Gsensor检测结果的影响。结果表明,在U937细胞中miR142-3p Gsensor表现的miR142-3p活性在48h后趋于稳定;Gsensor转染剂量在0.001~0.05pg/cell范围内不影响其功能。最后,利用miR142-3p Gsensor检测了HEK293、U937、K562、SP2/0和P815细胞内miR142-3p活性,结果发现miR142-3p活性在U937、K562、SP2/0和P815细胞中均较高,而在HEK293中几乎没有活性。用QRT-PCR方法检测miR142-3p的相对拷贝数。结果表明,在HEK293、U937和K562细胞中,miR142-3p活性与其相对拷贝数呈正相关。本研究表明Gsensor可作为一种有效的miRNA活性检测工具,为体外实时动态监测miRNA活性提供了一种新方法。 展开更多
关键词 MIRNA miRNA活性 Gsensor 监测
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高通量miRNA活性谱检测发现BHK21细胞中miR-206高活性
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作者 田文洪 董小岩 +4 位作者 王刚 郑刚 周庆璋 董哲岳 吴小兵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1016-1026,共11页
用我们建立的活细胞miRNA活性谱检测技术测定BHK21、HEK293和Vero三种肾来源细胞系中58种miRNA活性谱,发现miR-206在BHK21细胞中具有特征性高活性。鉴于miR-206是典型的横纹肌特征性miRNA,进一步以小鼠成肌细胞C2C12及人胚肾细胞HEK293... 用我们建立的活细胞miRNA活性谱检测技术测定BHK21、HEK293和Vero三种肾来源细胞系中58种miRNA活性谱,发现miR-206在BHK21细胞中具有特征性高活性。鉴于miR-206是典型的横纹肌特征性miRNA,进一步以小鼠成肌细胞C2C12及人胚肾细胞HEK293为对照,检测了BHK21细胞中miR-206的活性及表达水平。之后,用马血清诱导培养BHK21细胞,检测诱导前后BHK21细胞中骨骼肌肌球蛋白重链(Slowskeletal myosin heavy chain,MHC)表达情况,miR-206活性和表达水平以及受miR-206负调控的Connexin43(Cx43)的表达水平。结果发现,miR-206在BHK21细胞中活性和表达水平都明显高于C2C12细胞;马血清诱导后,BHK21细胞中MHC表达水平升高,miR-206活性和表达水平都升高,而Cx43表达水平下降。结果提示BHK21细胞具有成肌细胞特性。本研究首次发现BHK21细胞中miR-206的高活性,从miRNA角度证实了BHK21细胞来源于肾间质细胞,而不是肾实质细胞。研究结果还提示BHK21细胞有可能作为一种体外模型用于miR-206的功能研究。 展开更多
关键词 miR-206 BHK21细胞 miRNA活性
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用生物传感器方法测定正常小鼠肝脏中miR-21活性
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作者 田文洪 胡键阳 +2 位作者 董小岩 李明皓 吴小兵 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期60-66,共7页
目的:建立生物传感器检测小鼠肝脏中microRNA(miRNA)活性的方法,测定miR-21在正常小鼠肝脏中的活性。方法:首先,分子克隆方法构建检测miRNA活性的通用型质粒传感器Dsensor。将各种miRNA的互补序列插入Dsensor中构建成相应miRNA活性检测... 目的:建立生物传感器检测小鼠肝脏中microRNA(miRNA)活性的方法,测定miR-21在正常小鼠肝脏中的活性。方法:首先,分子克隆方法构建检测miRNA活性的通用型质粒传感器Dsensor。将各种miRNA的互补序列插入Dsensor中构建成相应miRNA活性检测传感器。用水动力法将检测miR-21的Dsensor注射至正常小鼠体内,以miR-122 Dsensor为阳性对照,miR-206Dsensor为阴性对照,以不插入任何miRNA互补序列的Dsensor为空白对照。不同时间点尾静脉采血测定Gluc表达,处死小鼠测定肝脏中Fluc表达,比较计算得出miRNA活性。最后,用QRT-PCR法测定小鼠肝脏组织中miR-21、miR-122和miR-206表达水平。结果:用RIF(Relativeinhibiting fold)值表示miRNA活性,miR-21、miR-122和miR-206活性分别为80.03±21.25,29.90±5.90和0.92±0.29,表明小鼠正常肝脏中miR-21的负调控活性明显高于miR-122。然而,QRT-PCR法测定结果显示,miR-21的表达水平明显低于miR-122,而miR-206几乎没有表达。从miR-21与miR-122的活性与表达水平比较发现,miR-21的表达水平并没有真实反映其活性。结论:成功建立了一种小鼠肝脏中miRNA活性检测方法;首次发现小鼠正常肝脏中miR-21活性水平比miR-122更高,而表达水平却明显低于miR-122。提示miR-21对于维持肝脏的正常生理功能的重要作用,值得进一步研究其调控的靶基因和机理。 展开更多
关键词 MIRNA MIR-21 miR-21活性 肝脏
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过表达Lin28a/Lin28b对let-7家族活性的影响 被引量:2
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作者 刘雪荣 田文洪 +3 位作者 董小岩 吴效哲 吕建新 吴小兵 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期533-541,共9页
研究在HeLaS3细胞中过表达Lin28a/Lin28b对let-7家族miRNA表达水平和活性的影响。首先,构建Lin28a和Lin28b的表达载体pAAV2neo-Lin28a和pAAV2neo-Lin28b,分别转染HeLaS3细胞并筛选获得Lin28a和Lin28b的稳定表达细胞株HeLaS3/pAAV2neo-Li... 研究在HeLaS3细胞中过表达Lin28a/Lin28b对let-7家族miRNA表达水平和活性的影响。首先,构建Lin28a和Lin28b的表达载体pAAV2neo-Lin28a和pAAV2neo-Lin28b,分别转染HeLaS3细胞并筛选获得Lin28a和Lin28b的稳定表达细胞株HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b。然后,以pAAV2neo-Gluc-(Fluc)为基本骨架,构建并获得检测let-7家族miRNA活性的8种质粒型载体,并包装为相应的重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV),作为检测miRNA靶序列介导的转录后抑制活性的传感器,命名为Asensor。在此基础上,以HeLaS3细胞为对照,用Western blot检测HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b细胞中Lin28a和Lin28b表达水平,用QRT-PCR测定let-7家族各成员表达水平,用Asensor检测let-7家族各成员活性。Western blot结果显示,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b均能有效地表达Lin28a和Lin28b蛋白;QRT-PCR检测结果显示,相比于HeLaS3细胞,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a细胞中let-7家族各成员表达水平都下降(除let-7e外),但不同成员下降幅度存在差异;Asensor检测结果显示,let-7家族所有成员活性水平都下降,但不同成员下降幅度也存在差异,且同一成员活性水平与表达水平及其下降趋势也不一致。相比于HeLaS3细胞,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b细胞中let-7家族成员的表达和活性水平均明显下降,但表达水平的下降幅度比HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a细胞大,而活性的下降幅度却与之相近。本研究建立了一种检测和比较miRNA靶序列介导的转录后抑制活性的方法,首次研究了过表达Lin28a和Lin28b对细胞中的let-7家族miRNA活性影响,并发现Lin28a和Lin28b对let-7家族miRNA表达水平的影响和对其相应活性的影响不一致性,说明在检测miRNA表达水平的同时检测miRNA活性能更全面揭示miRNA的调节功能,为进一步研究let-7家族的调控机制奠定了基础。 展开更多
关键词 Lin28a Lin28b let-7家族 活性 过表达
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仙台病毒BB1株6个编码基因的克隆及表达 被引量:1
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作者 张海凤 杨宇 +1 位作者 董小岩 吴小兵 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期213-219,共7页
在仙台病毒BB1株全基因组序列测定的基础上,用反转录和PCR方法获得了核蛋白基因(N),磷蛋白基因(P),神经血凝素基因(HN),基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)和聚合酶蛋白基因(L)等6个编码基因全长克隆;测序结果表明,其序列与Genbank中登... 在仙台病毒BB1株全基因组序列测定的基础上,用反转录和PCR方法获得了核蛋白基因(N),磷蛋白基因(P),神经血凝素基因(HN),基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)和聚合酶蛋白基因(L)等6个编码基因全长克隆;测序结果表明,其序列与Genbank中登录的序列(DQ219803)完全一致。为了提供仙台病毒基因组载体拯救和包装所需的反式作用蛋白,将N、P、M、F、HN和L分别克隆到腺病毒穿梭表达载体pDC316上,将它们分别与腺病毒基因组质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,获得了6种复制缺陷性重组腺病毒Ad5-N、Ad5-P、Ad5-M、Ad5-F、Ad5-HN和Ad5-L。酶切结果表明6种重组腺病毒穿梭质粒构建正确;用PCR方法证明所获得的6种重组腺病毒分别携带了上述6个编码基因;用重组腺病毒感染LLC-MK2细胞后用Western blotting和免疫荧光方法检测到了相应仙台病毒编码基因的表达。本研究为仙台病毒BB1株全长基因组的拼接和病毒载体包装系统组建打下了基础。 展开更多
关键词 副粘病毒科 仙台病毒 BB1株 腺病毒载体
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罕见病基因治疗与孤儿药 被引量:3
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作者 刘海燕 齐香荣 +5 位作者 刘春国 余双庆 戴阳光 周庆璋 董小岩 吴小兵 《药学进展》 CAS 2016年第6期411-419,共9页
孤儿药因面向的罕见病患者群小、市场需求低、研发成本高、缺乏政策支持等,其发展面临困境。随着精准医疗概念的提出,基因治疗因能够从根本出发,给患者提供"一劳永逸"的治疗,备受关注。基因治疗以单基因罕见病的治疗作为极佳... 孤儿药因面向的罕见病患者群小、市场需求低、研发成本高、缺乏政策支持等,其发展面临困境。随着精准医疗概念的提出,基因治疗因能够从根本出发,给患者提供"一劳永逸"的治疗,备受关注。基因治疗以单基因罕见病的治疗作为极佳切入点,为孤儿药的研发带来了新的希望。概述基因治疗针对的疾病对象、实施策略和属性以及基因药物的结构及基因治疗的载体,以血友病的基因治疗为例回顾罕见病基因治疗的发展,并分析罕见病基因治疗药物研发现状。 展开更多
关键词 罕见病 基因治疗 孤儿药
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比较不同血清型AAV携带HBV基因组建立乙肝小鼠模型效果
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作者 朱欣瑶 周庆璋 +4 位作者 田文洪 刘春国 董小岩 吴小兵 喻长远 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1764-1772,共9页
近年来,用8型腺相关病毒携带1.3拷贝HBV(Hepatitis B virus)基因组建立的HBV持续感染小鼠模型受到越来越多的关注。本研究比较了除AAV8之外的其他4种血清型重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)建立乙肝小鼠模型效... 近年来,用8型腺相关病毒携带1.3拷贝HBV(Hepatitis B virus)基因组建立的HBV持续感染小鼠模型受到越来越多的关注。本研究比较了除AAV8之外的其他4种血清型重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)建立乙肝小鼠模型效果。首先,将携带1.3拷贝ayw亚型HBV基因组的1型、2型、5型、8型、9型腺相关病毒分别以1×10^(11) vg/只(Viral genome,vg)的剂量尾静脉注射C57BL/6J小鼠;利用ELISA方法监测小鼠血清中HBeAg和HBsAg表达水平;用定量PCR方法检测小鼠血清和肝脏中HBV DNA拷贝数;用免疫组化方法检测小鼠肝脏中HBc Ag的表达;用HE染色检测小鼠肝脏病理变化。结果显示,在持续8周中,5组小鼠血清中都检测到HBeAg和HBsAg的表达,血清和肝脏中均检测到HBV DNA的存在。HBeAg、HBsAg、HBV DNA表达水平高低依次为AAV8>AAV9>AAV1>AAV5>AAV2。5组小鼠用免疫组化方法都检测到肝脏中HBcAg表达,HE染色病理检测均观察到不同程度的肝损伤。本研究扩大了能用于建立乙肝小鼠持续感染模型可选择的AAV载体种类,发现虽然AAV1、2、5、9的建模效果不如AAV8,但它们都可以介导建立持续感染的乙肝小鼠模型,建模效果依次为AAV8>AAV9>AAV1>AAV5>AAV2。其中AAV9介导的建模效果与AAV8载体最为接近,可以替代AAV8载体用于有效地建立HBV持续感染的小鼠模型。 展开更多
关键词 动物模型 乙型肝炎病毒 AAV 持续感染
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