北京地区上呼吸道感染儿童青霉素不敏感肺炎链球菌的血清型分布研究

目的了解青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSP)的耐药性和血清型分布。方法以2000～2004年门诊上呼吸道感染的0～5岁患儿鼻咽部分离的肺炎链球菌为研究菌株,采用E-test法检测青霉素最低抑菌浓度,简易棋盘式分型系统进行血清分型。结果检出PNSP菌株129株,其中中介102株,耐药27株;2000～2004年各年耐药株占PNSP比率分别为19.0%、8.0%、17.6%、30.0%和26.1%;常见血清型共有124株(96.1%),为19群、23群、不能分型、6群和14型;7价结合疫苗覆盖率从2000年到2004年分别为57.1%、76.0%、88.2%、75.0%和82.6%。结论北京儿童中分离的PNSP的青霉素耐药性有所增强;7价结合疫苗覆盖率升高,有利于应用疫苗来预防PNSP的携带、感染及耐药性的进一步播散。

Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的重组表达Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白(Surfaceimmunogenicprotein,SIP)基因,为进一步免疫学研究提供目标蛋白。方法用PCR的方法从GBSⅡ型标准株的基因组DNA中扩增出SIP基因,用T/A克隆法将其插入pMD18T载体,构建原核表达载体pET32aSIP,用BL21(DE3)/pET系统表达TrixSIP融合蛋白,SDSPAGE和质谱分析鉴定表达产物,并对表达蛋白进行初步纯化。结果PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中Ⅰa/c型GBS的SIP的基因序列同源性为99%。SDSPAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET32aSIP总蛋白中出现一条相对分子质量为66000的新蛋白带。质谱分析和蛋白质库的比较证实其为B族链球菌表面免疫相关蛋白(SIP)的可能性分数为74。结论已成功表达并初步纯化SIP,为SIP在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。

儿童肛门周围脓肿99例临床分析

肛管、直肠周围间隙的化脓性感染并脓肿形成称为肛门周围脓肿（简称肛周脓肿）,儿童较常见,可发展为肛瘘.目前临床对肛门杂病的重视程度远远落后于家长的要求[1].分析儿童肛周脓肿的临床特征及病原学特点,对有效预防和及时治疗具有重要意义.本文对2008年9月至2009年3月北京儿童医院外科门诊99例14岁以下儿童肛周脓肿患儿进行调查,现将结果介绍如下.

B族链球菌表面免疫原性蛋白的免疫原性及其抗体保护功能

目的制备B族链球菌(GBS)表面免疫原性蛋白(Sip),研究其免疫原性及抗体保护功能,为GBS蛋白疫苗研究奠定基础。方法采用基因重组技术构建表达载体,并表达GP-Sip融合蛋白。用pET-Sip融合蛋白免疫小鼠,并免疫家兔制备多克隆抗体。Western blot检测GP-Sip蛋白特异性,ELISA检测家兔及小鼠血清中特异性抗体水平,调理吞噬试验检测Sip抗血清的功能。结果表达载体经酶切和测序证明构建正确,GP-Sip蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,纯化后纯度可达90%以上。Western blot显示GP-Sip蛋白可与pET-Sip蛋白的免疫血清发生免疫反应。ELISA显示Sip可诱发小鼠产生高水平的IgG抗体。Sip抗血清具有明显地促进吞噬细胞对GBS的吞噬作用。结论已成功构建GP-Sip表达载体,并高效表达了Sip。该蛋白具有良好的免疫原性,其抗体具有良好保护功能,可作为GBS蛋白疫苗成分或荚膜多糖疫苗载体成分。

分子生物学方法在新生儿肺炎死亡病例大肠埃希菌的检测应用

目的探讨新生儿重症肺炎死亡病例中大肠埃希菌(E.coli)感染的地位。方法收集北京儿童医院新生儿重症肺炎组200例和非感染性疾病(对照组)34例的尸检病理标本,应用PCR和Southern blot技术检测E.coli特异性uidA基因片断,并复习患儿临床资料。结果肺炎组中,PCR和Southern blot对E.coli检出率明显高于对照组(PCR:5.0% vs. 0,掊2=11.37,P<0.01;Southern blot:21.5% vs. 5.9%,掊2=4.56,P<0.05);晚发型肺炎E.coli检出率明显高于早发型(PCR:8.2%vs.1.9%,掊2=4.18,P<0.05;Southern blot:26.8% vs. 16.5%,掊2=4.48,P<0.05)。1980年前E.coli检出率高于1981年后(Southern blot法:28.0%vs.15.0%,掊2=5.00,P<0.05)。E.coli检测阳性组和阴性组比较,临床表现的差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论 E.coli是新生儿重症肺炎死亡病例中的重要病原。分子生物学方法检测E.coli对早期诊断有重要价值。

儿童肺炎链球菌和流感嗜血杆菌疾病及其疫苗预防

肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,Sp)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae,Hi)是儿童社区获得性感染的重要病原,能引起化脓性脑膜炎(化脑)、肺炎、败血症和急性中耳炎等感染性疾病,严重危害儿童健康。因此,在儿童人群中,预防这两种细菌感染尤显重要。已经投入应用的Sp和Hib结合疫苗已经通过临床研究,能有效预防儿童Sp和Hib疾病,降低发病率,保障儿童健康。在我国,医务和预防工作人员应共同努力,加强对Sp和Hib疾病的研究,为疫苗研制和应用提供必要和充分的依据。

2000—2002年北京、上海和广州儿童肺炎链球菌携带及抗生素耐药性监测

目的了解当前我国儿童携带肺炎链球菌情况,及该菌对常用抗生素的敏感性分布,为临床合理用药提供依据。方法2000—2002年于北京、上海和广州3家儿童医院门诊就诊的年龄为1个月至5岁急性上呼吸道感染儿童鼻咽部分离肺炎链球菌,采用纸片扩散法和E-test法检测菌株对10种抗生素的敏感性。结果肺炎链球菌分离率24·9%。肺炎链球菌对青霉素的不敏感率达39·9%,耐药率6·4%;20·4%的菌株对头孢克洛耐药;19·0%的菌株对头孢呋辛不敏感;肺炎链球菌对阿莫西林/克拉维酸和头孢曲松的敏感率分别为98·5%和97·2%。对红霉素、复方新诺明和四环素的不敏感率都在80·0%以上。98·0%的菌株对环丙沙星敏感。3城市肺炎链球菌抗生素敏感性变化有各自的特点。耐药模式分析表明多重耐药率达88·7%,青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSP)较青霉素敏感菌(PSSP)更为多见(99·1%和78·8%,P<0·01);红霉素不敏感菌株较红霉素敏感菌株也更为多见(95·8%和17·1%,P<0·01)。结论我国肺炎链球菌对抗生素的耐药状况已很严峻,不同地区肺炎链球菌的耐药性变化具有不同特点。必须加强各地肺炎链球菌耐药性和抗生素使用情况的监测,及时调整经验用药方案和公共卫生策略。

2000-2002年三家儿童医院分离的肺炎链球菌血清型分布及其对β内酰胺类抗生素敏感性的变化

目的了解当前我国儿童人群中肺炎链球菌血清型分布,及不同血清型菌株对β内酰胺类抗生素的敏感性变化,评估疫苗在预防肺炎链球菌感染及控制其耐药性流行中的价值。方法以2000-2002年于北京、上海和广州三家儿童医院门诊分离的625株肺炎链球菌为研究对象,应用简易棋盘式肺炎链球菌分型系统检测血清型,分析肺炎链球菌7价结合疫苗(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)覆盖率;采用E-test最小抑菌浓度(MIC)法检测分离菌株对5种β内酰胺类抗生素的敏感性。结果最常见的血清型/群为19群,共121株(19·4%),其次是23群(15·4%)、6群(13·3%)、14型(6·6%)和15群(4·3%)。140株(22·4%)不能分型,还有117株(18·7%)属于其他28种少见的血清型/群。肺炎链球菌7价结合疫苗覆盖约360株,占57·6%;其中,血清型/群4、9和18分别有1、6和12株,共计占3·0%。常见血清型/群中,19群和23群与青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSP)明显有关,其他血清型/群与PNSP无明显相关。结论常见的血清型为19群、23群、6群、14型和15群,19群和23群与PNSP明显相关。肺炎链球菌7价结合疫苗可覆盖多数分离株。

A群β溶血性链球菌药敏试验及大环内酯类抗生素耐药基因检测

目的研究我国儿科A群β溶血性链球菌(GAS)临床分离株抗菌药物敏感性情况。方法收集5所儿童医院2005—2006年222株GAS感染的临床菌株,采用琼脂稀释法测定11种抗菌药物的MIC值;诱导试验分析大环内酯类抗生素耐药表型;PCR检测大环内酯类抗生素耐药基因ermB、ermTR和mefA。结果分离株对大环内酯类抗生素和克林霉素耐药率在93.69%～98.65%,MIC90>512mg/L;对四环素的耐药率为94.14%;对青霉素、头孢他啶的敏感率高达100%。分离株大环内酯类抗生素耐药以耐大环内酯类、林可酰胺类和链阳性菌素B表型(cMLS)为主,占99.04%,iMLS表型仅2株,未检测到M型;ermB、ermTR和mefA阳性率分别为94.71%、2.89%和0。结论所测儿科GAS感染流行菌株对大环内酯类抗生素和克林霉素耐药率高,主要耐药机制为ermB编码的23SrRNA甲基化酶导致靶位改变,青霉素类和头孢菌素类抗生素是治疗我国GAS感染首选药物。

百日咳杆菌抗生素敏感性检测结果分析

目的了解百日咳杆菌对抗生素的敏感性情况,为临床合理用药提供依据。方法以2000年7月至2007年4月北京儿童医院临床分离的16株和20世纪70年代的4株百日咳菌株为研究对象,采用琼脂稀释法、E test法和纸片扩散法检测菌株对红霉素的敏感性,其中琼脂稀释法还检测了菌株对阿齐霉素、克拉霉素、克林霉素和环丙沙星4种抗生素的敏感性。结果3种方法检测2000年以后菌株对红霉素的敏感性结果显示,琼脂稀释法MIC均为0.125μg/ml,E test MIC范围0.047～0.125μg/ml,纸片扩散法抑菌环直径都>42 mm(范围45～55 mm)。琼脂稀释法检测2000年以后菌株阿齐霉素、克林霉素的MIC范围分别为0.031～0.063μg/ml、0.25～2μg/ml;克拉霉素和环丙沙星的MIC分别为1μg/ml和2μg/ml。与20世纪70年代百日咳菌株相比,2000年以后菌株对5种抗生素的敏感性没有下降。结论本研究未发现红霉素耐药株,2000年以后分离的16株百日咳菌株对红霉素均敏感,治疗百日咳仍可首选红霉素。

住院新生儿大肠埃希菌分离株毒力因子研究

目的了解住院新生儿大肠埃希菌毒力因子的携带情况。方法收集2009年9月至2012年5月临床诊断为新生儿肺炎、败血症的连续病例,选择其中抗生素使用之前痰液、血液、脑脊液或脐分泌物培养为大肠埃希菌的病例。根据发病日龄不同,将菌株分为早发型及晚发型。根据标本来源不同,将菌株分为侵袭性感染和非侵袭性感染。选取11种最常见的毒力基因,应用PCR方法对大肠埃希菌菌株进行检测。采用Chromas软件进行读序,测序结果采用Chromas软件直接进行BLAST Search比对。结果 110株大肠埃希菌分离自102例住院新生儿,源于痰液79株(71.8%),血液18株(16.4%),脑脊液6株(5.4%),脐分泌物7株(6.4%);源于足月儿102株,早产儿8株。早发型27株,晚发型83株;侵袭性感染24株,非侵袭性感染86株。1Einv基因阳性91.8%,CNF1基因阳性21.8%,CNF2基因阳性12.7%,Eagg基因0.9%;共有7种毒力基因携带模式:单纯携带Einv基因66株,单纯携带CNF1基因1株,携带Einv-CNF1基因20株,携带Einv-CNF2基因11株,携带Einv-CNF1-CNF2基因3株,携带Einv-Eagg基因1株。8株(7.3%)11种毒力基因检测均阴性。2携带CNF1或CNF2菌株的37例患儿中22例合并呼吸衰竭,15例需予NCPAP呼吸支持,10例合并多脏器受损,3例肺出血。38对菌株分别来自同一患儿不同时期或不同部位,其中7对菌株经PFGE分型分别属于同一基因型。3对分别来源于同一患儿不同时期的痰液标本菌株,PFGE分型一致,但毒力基因携带模式不相同。结论本研究检测到4种大肠埃希菌毒力基因,以Einv基因携带率最高;共发现7种毒力基因携带模式,以单纯携带Einv基因最多见。CNF1及CNF2基因可能与肺部感染的严重性相关。

肺炎链球菌致急性化脓性心包炎1例并文献复习

目的了解肺炎链球菌致急性化脓性心包炎的主要表现,加强对该病的认识。方法报道1例肺炎链球菌所致的急性化脓性心包炎患儿的临床表现及预后,并结合文献复习。结果 14月龄患儿,既往体健,因"呼吸急促7d,咳嗽3d"入院。血常规WBC、CRP显著升高。肺CT和超声心动图均提示心包积液。心包积液培养为肺炎链球菌100%,确诊为肺炎链球菌化脓性心包炎,血清型鉴定为6A型。予利奈唑胺抗感染治疗,好转后出院,随访6个月超声心动图仅提示心包膜稍增厚。检索PubMed数据库发现16例该病患儿报道,结合本文报道的1例,男9例,女7例,另1例性别不详;年龄4月至17岁,其中2岁以下10例;3例有基础疾病。血常规提示WBC明显升高,以多核细胞为主,CRP明显升高。心包积液外观为黄棕色脓性,常规及生化表现为典型化脓性积液改变;超声心动图及肺CT/X线检查均提示中至大量心包积液;合并肺炎2例,胸腔积液4例,心包填塞3例。9例报道药物敏感试验结果,其中8例为青霉素敏感菌株,1例为青霉素耐药菌株。7例报道血清型,其中6A、14、23F型各2例,34型1例。2/6例换用万古霉素,16例行心包穿刺引流。15例预后较好,2例死亡。结论肺炎链球菌化脓性心包炎病例有增多趋势,儿童既往常健康,通过积极治疗,预后较良好。

不同血清型肺炎链球菌对非β内酰胺类抗生素的耐药性

目的了解不同血清型的肺炎链球菌对非β内酰胺类抗菌药物的耐药特点。方法以2000—2002年于北京、上海和广州3所儿童医院门诊分离的625株肺炎链球菌为研究对象,应用简易棋盘式肺炎链球菌分型系统分析血清型;采用E试验(青霉素和红霉素)和K-B纸片扩散法(复方磺胺甲噁唑、四环素和氯霉素)检测菌株对抗菌药的敏感性。结果常见的血清型/群为19群、23群、6群和14型。常见血清型菌株对红霉素、四环素、复方磺胺甲噁唑不敏感率均明显高于其他少见血清型和不能分型组。青霉素不敏感菌(PNSP)对红霉素和复方磺胺甲噁唑的不敏感率明显高于青霉素敏感菌(PSSP);不能分型的PNSP对红霉素和复方磺胺甲噁唑的不敏感率也明显高于PSSP;19群的PNSP红霉素和四环素不敏感率明显高于PSSP,氯霉素耐药率明显低于PSSP;23、6、14和其他少见血清型/群菌株PNSP和PSSP之间,各抗菌药物不敏感率差异并无统计学意义。结论常见的19、23、6和14型/群肺炎链球菌对红霉素、复方磺胺甲噁唑和四环素耐药率高于其他少见血清型和不能分型菌株,PNSP与PSSP对部分非β内酰胺类抗生素不敏感率的差异可能与血清型分布有关。

B族链球菌C5a肽酶功能活性区域的分段表达

目的表达B族链球菌C5a肽酶蛋白功能活性区域,为进一步研究及开发疫苗奠定基础。方法设计引物,从GBSⅡ型标准株的基因组DNA中扩增出含有C5a肽酶蛋白不同功能区域基因的4个目的片段,分别插入T载体,再经酶切后,插入原核表达载体PET32a,进行融合表达。对表达蛋白进行免疫原性检测,并通过镍柱大量纯化。结果成功构建4个目的片段的PET表达质粒。经SDS-PAGE检测表达的融合蛋白相对分子质量分别为80000、78000、70000和36000。蛋白质谱分析证实,表达的4个蛋白为B族链球菌C5a肽酶蛋白的可能性分数分别为82、152、113和79。免疫印迹证实均能与特异性抗C5a肽酶蛋白的抗体反应,纯化后的蛋白SDS-PAGE纯度达90%。结论已成功地表达了可溶性C5a肽酶蛋白4个功能活性区域,为蛋白免疫表位和毒力机制的研究以及亚单位蛋白疫苗的制备奠定了基础。

分离肺炎链球菌主群与耐药亚群的简易方法

目的 :研究分离肺炎链球菌苯唑西林 (OX)纸片清晰抑菌环内散在克隆与产生清晰抑菌环的主要克隆的简易方法。方法 :以OX纸片清晰抑菌环内存在散在克隆的 4株临床分离株R0 137、S10 39、R12 84和R2 0 34为研究对象 ,用常备的药敏培养基和OX纸片尝试分离散在克隆和主要克隆 ,并以青霉素结合蛋白基因 (pbp) pbp1a、pbp2b和pbp2x限制性片段长度多态性 (RFLP)分析和盒式 聚合酶链反应 (BOX PCR)菌株亲缘关系鉴定研究所分离菌株间的关系。结果 :于同一菌株分离出的克隆OX纸片药敏检测结果均不一致 ;除S10 39外 ,青霉素Etest检测结果也不一致。从R0 317、S10 39各分离出 2株 ,2株间 pbp酶切图谱相同 ,BOX PCR属于同一型 ;而从R2 0 34分离出的 2株 ,pbp酶切图谱与BOX PCR均不相同 ;从R12 84分离出 3个具有不同药敏表型的克隆 ,其中 2株 pbp1a和 pbp2b酶切图谱相同 ,BOX PCR属于同一型 ;另外 1株pbp2b酶切图谱与前 2株相同 ,而 pbp1a和 pbp2x不同 ,BOX PCR属于不同型。结论 :用药敏培养基和药敏纸片可成功分离不同耐药水平的混合菌株 ,方法简单易行。对所分离的菌株的分子生物学研究可能揭示自然过程中耐药基因逐步变异的特征。

2000至2002年北京儿童中青霉素不敏感肺炎链球菌的血清型分布和同源性研究

研究表明青霉素不敏感肺炎链球菌（peniciHinnonsusceptible Streptococcus pneumoniae，PNSP）的克隆传播是其流行的重要因素，我们也证实克隆传播是北京地区PNSP流行的重要因素。进一步血清分型可为抗生素耐药性和流行克隆分析提供更多信息，为推广接种疫苗预防PNSP感染和控制其传播提供依据。