2020年免疫血液学研究进展

免疫血液学作为输血医学的核心领域之一,以减少或避免供受者免疫反应,保证输血安全为要务。围绕新血型系统确立,分子诊断在免疫血液学应用、实验室质量保证等,对2020年免疫血液学领域相关研究进展进行了梳理和概述。

小鼠胎肝细胞透明质酸3D培养体系的建立

为了利用透明质酸建立小鼠胎肝细胞3D培养体系,分离获得胚胎12~14d胎肝细胞,利用KM培养基进行初步2D肝干/祖细胞的筛选培养,并利用透明质酸及KM培养基配制水凝胶建立3D细胞培养体系.胎肝细胞在2D体系中呈现克隆状生长.分离培养获得的肝干/祖细胞,克隆在透明质酸建立的3D培养体系保持增殖活性,并进一步获得肝细胞功能特性,表现为3D培养上清中白蛋白合成和尿素水平显著增加.定量PCR结果显示,随着3D培养时间的延长,其肝细胞干性标志如AFP、CK19、Ep CAM、Prox1等表达水平都大幅度降低且接近成年小鼠肝脏表达水平.本研究成功建立基于透明质酸的小鼠胎肝细胞的3D无血清培养体系,并可促进小鼠胎肝细胞的肝细胞功能进一步成熟.

无源型低温血液运输箱的研制

目的研制速冻箱及无源型血液运输箱,用于战时深低温保存红细胞的短途运输。方法速冻箱采用深冷混合工质节流制冷机作为冷源,有效容积约为60 L。运血箱由填充相变介质HFC-4310mee的不锈钢封装盒和保温箱组成,内部有效容积约为10 L。结果速冻箱空载时,箱内温度从常温降至-80℃,所需时间约为70 min,箱内极限温度为-128℃,降温时间约180 min;负载后箱内温度降至-125℃,约需500 min。将封装盒从-125℃条件下速冻箱中取出移至运血箱中,随后从-80℃冰箱中取出冰冻红细胞(用水替代) 15袋(500 ml/袋)放入运血箱,运血箱内温度维持在-65℃以下的时间可达到10 h。结论研制的低温速冻箱及配套使用的相变材料运血箱可实现红细胞低温保存的短途便携运输。

外周血单个核细胞诱导为肝细胞样细胞及初步探讨对乙酰氨基酚作用下的细胞损伤反应

目的建立外周血单个核细胞诱导肝细胞样细胞的方法,初步探讨其在对乙酰氨基酚(APAP)作用下的细胞损伤反应。方法流式细胞术和免疫荧光法检测外周血分离的单个核细胞表面标志CD45;针对诱导的肝细胞样细胞,倒置显微镜观察细胞形态,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肝细胞特异性基因细胞色素P450(CYP)1A2、CYP3A4、CYP2C9、白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、肝细胞核因子(HNF)4α mRNA的表达水平;免疫荧光法检测肝细胞标志物AFP、HNF4α、ALB在细胞中蛋白的表达水平,生化分析仪检测肝细胞特有的AFP、ALB、尿素的分泌功能,荧光素酶化学发光法检测肝细胞关键药物代谢酶CYP3A4酶活性;肝损伤药物APAP作用肝细胞样细胞后,比色测定法检测肝细胞损伤指标丙氨酸转氨酶(ALT)。采用t检验与秩和检验比较数据间的统计学差异。结果外周血分离的单个核细胞表面标志CD45表达阳性率约98%,诱导第15天细胞形态出现肝细胞样变化;与分离的单个核细胞相比,CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、ALB、AFP、HNF4α mRNA明显升高,AFP、ALB,HNF4α蛋白表达水平均升高,AFP、ALB,尿素的分泌功能增强;与原代肝细胞相比CYP1A2、CYP2C9、AFP、HNF4α mRNA,CYP3A4 mRNA无降低,ALB mRNA较低,AFP、ALB、HNF4α蛋白在细胞中的表达水平无降低,AFP、ALB,尿素的分泌功能无降低。此外肝细胞样细胞产生了与原代肝细胞相似的CYP3A4酶活性;APAP孵育较不含APAP孵育的肝细胞样细胞会释放更多的ALT;在APAP作用下肝细胞样细胞相比分离的单个核细胞ALT释放增加。结论外周血单个核细胞能诱导为具有肝细胞部分特性的肝细胞样细胞,通过诱导具有了肝细胞关键药物代谢酶CYP3A4活性,肝损伤药物APAP作用下,肝细胞样细胞初步体现了肝细胞损伤时ALT分泌的特征。

RUNX1c及GATA2表达质粒构建及其在肝细胞中表达的鉴定

目的构建含RUNX1c及GATA2基因的表达质粒,探讨水动力转染法能否实现其在小鼠肝中的表达。方法采用PCR方法分别扩增RUNX1c及GATA2基因序列,并分别连入T载体中,通过双酶切、连接反应将2个基因序列分别连入慢病毒载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中。将含RUNX1c及GATA2基因的慢病毒毒液转染至L-02细胞,通过qPCR方法检测目的基因表达。通过水动力高压转染方法将此两种质粒通过尾静脉注入小鼠体内,于转染24 h,取小鼠肝组织,对组织切片进行抗RUNX1及GATA2抗体的免疫荧光染色;于转染72 h,通过流式细胞术分选肝组织中GFP+细胞,实时定量PCR(qPCR)检测RUNX1c、GATA2及造血相关基因的表达。结果经双酶切及测序鉴定证明,pCDH-MCS-T2A-RUNX1c-copGFP-MSCV、pCDH-MCS-T2A-GATA2-copGFP-MSCV质粒构建成功。通过体外实验证实这两个载体携带的RUNX1c及GATA2基因能在人肝细胞系L-02中表达。水动力高压转染法可使含RUNX1c及GATA2的质粒进入肝组织,并在肝细胞中表达RUNX1及GATA2蛋白。通过分选肝组织中GFP+细胞,可发现这些细胞内过表达RUNX1及GATA2基因,Fli-1、Erg基因的表达也明显提高。结论成功构建了含有造血转录因子RUNX1c、GATA2基因的表达载体,并通过水动力转染法实现RUNX1c、GATA2的表达载体在小鼠肝中的表达,为进一步研究肝中过表达造血转录因子能否实现肝细胞转分化为造血细胞及观察其对造血系统修复的作用奠定基础。