人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的克隆hTERT启动子,并观察hTERT启动子调控下tk/GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法设计特异性引物,以HepG2基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hTERT启动子;分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体;将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后,通过RT-PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况;用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果成功克隆hTERT上游-280bp^+40bp的核心启动子。RT-PCR和β-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达;hTERT启动子调控的tk/GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞,表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。

打造个性化的肿瘤治疗方案

自古以来，我国的中医就有“同病不同治，同治不同病”的理论，这充分说明没有一成不变的病症，也没有一成不变的治疗方案。恶性肿瘤的治疗当然也不例外。国内外医学界专家、学者经过长期的研究与临床实践，目前普遍认为，恶性肿瘤的治疗应该因人而异，制定个性化的治5疗方案。

尾加压素Ⅱ在肺癌患者血浆中的表达及其临床意义

目的:探讨尾加压素Ⅱ(U-Ⅱ)在肺癌患者血浆中的表达及其与肺癌分期及病理类型的关系。方法:采用放射免疫分析法测定16例健康人,35例非肺癌患者及74例肺癌患者血浆中U-Ⅱ含量,并进行统计学分析。结果:健康对照组血浆U-Ⅱ含量2.836±1.159pmol/l,肺癌组U-Ⅱ血浆含量3.539±1.228pmol/l,两者相比有显著差异(P<0.05);非肺癌组血浆U-Ⅱ含量2.925±0.922pmol/l,与肺癌组相比有显著差异。小细胞肺癌组血浆U-Ⅱ含量2.867±1.836pmol/l,非小细胞肺癌组血浆U-Ⅱ含量3.223±1.905pmol/l,两者相比差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅰ-Ⅲ期肺癌组血浆U-Ⅱ含量明显低于Ⅳ期肺癌组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:U-Ⅱ在肺癌血浆申的表达水平增高,且U-Ⅱ表达水平与肺癌的分期及有无远处转移有关,与肺癌的病理类型无关。提示U-Ⅱ通过自分泌/旁分泌的方式,在肺癌的发生发展、侵袭及转移中起重要作用。深入研究U-Ⅱ可深化肺癌发病机制,对进一步揭示肺癌的发病机理有重要意义。

HBV感染产妇母乳喂养安全性研究

目的探讨HBV感染产妇母乳喂养是否增加幼儿HBV感染率。方法分析HBV感染产妇幼儿HBV的感染情况,比较母乳喂养和非母乳喂养幼儿的HBV感染率。结果采取一定的防范措施后,母乳喂养与非母乳喂养的幼儿HBV感染率无统计学差异。结论有条件的母乳喂养可能不增加幼儿HBV感染率。

VEGF-A和VEGF-C在乳腺癌组织中的表达及意义

目的探讨同时阻断血管内皮生长因子A(VEGF-A)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)的表达,是否能有效抑制肿瘤血管和淋巴管的新生,从而抑制肿瘤增殖和转移。方法收集临床手术切除、石蜡包埋的乳腺癌标本98例、转移淋巴结42例、癌前病变7例,观察乳腺癌组织中VEGF-A、VEGF-C、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况。结果 98例乳腺癌中癌细胞表达VEGF-A蛋白者84例(85.7%),89例VEGF-C染色阳性(90.8%)。VEGF-A、VEGF-C表达在淋巴结转移组明显高于未转移组(P<0.05)。随着VEGF-A、VEGF-C表达增强,PCNA表达渐增强,VEGF-A、VEGF-C分别与PCNA表达呈等级相关。结论 VEGF-A、VEGF-C可促进MCF-7细胞的增殖,阻断两者的表达。VEGF-A在乳腺癌间质血管生成中起重要促进作用。VEGF-A蛋白表达与乳腺癌淋巴结转移密切相关。

不同免疫途径对抗原肽修饰DC疫苗免疫效应的影响

目的探讨不同的免疫途径对抗原肽修饰树突状细胞(DC)疫苗免疫效果的影响。方法用鸡卵清蛋白(OVA)MHCⅠ限制性多肽SIINFEKL(OVAp257-264)包被小鼠骨髓来源的DC,通过皮下、腹腔、静脉或肌肉注射免疫小鼠,7天后行体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤实验(InvivoCTL)分析CTL杀伤活性和细胞内IFN-γ染色(ICS)分析免疫小鼠脾脏CD8+细胞产生IFN-γ的情况。结果免疫7天后,InvivoCTL结果显示SIINFEKL修饰的DC皮下、腹腔、静脉或肌肉注射免疫小鼠其特异性CTL杀伤效应分别是37.3%±7.3%、61.0%±4.2%、56.9%±3.6%和10.8%±2.3%;ICS结果示四组小鼠产生IFN-γ的CD8+细胞占总CD8+细胞的比例分别是0.31%±0.07%、0.85%±0.12%、0.76%±0.14%和0.15%±0.04%。结论不同免疫途径可明显影响抗原肽修饰DC疫苗的免疫效应,其中腹腔注射诱发的抗原特异性CTL反应最强,静脉注射者次之,而皮下注射特别是肌肉注射较弱,提示通过腹腔注射DC疫苗可能是安全、高效的免疫途径。

mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒的构建、表达及鉴定

目的:构建pCDNA3.1mGM-CSF-mM IP-3α重组质粒,为mGM-CSF-mM IP-3α基因治疗肿瘤的研究奠定基础。方法:利用本实验室保存的pCDNA3.1mGM-CSF和pCDNA3.1mM IP-3α质粒,采用分子生物学技术构建了pCDNA3.1mGM-CSF-mM IP-3α重组质粒。用PCR、酶切进行鉴定,然后用脂质体转染B16细胞,用G418筛选后通过ELISA和W estern b lot检测该融合蛋白。结果:重组质粒中含有mGM-CSF-mM IP-3α基因,转染B16细胞后,其表达产物能分泌到肿瘤细胞外,分泌到细胞外的产物用ELISA和W esternb lot检测证明能与特异性mGM-CSF和mM IP-3α抗体结合。结论:成功构建含mGM-CSF-mM IP-3α真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用。

hKDR基因胞外区mRNA转染树突状细胞诱发对表达mKDR的Hepa1-6细胞的特异性杀伤效应

目的探讨人血管内皮细胞生长因子受体-2(KDR)胞外段(Ig1~3)mRNA修饰的树突状细胞(DC)诱发的体外特异性细胞免疫效应。方法构建pmRNA IRES-hKDR)(Ig1~3),体外转录出相应的mRNA,Western blot鉴定其蛋白表达;以hKDR(Ig1~3)mRNA致敏来源于小鼠骨髓的DC,并免疫小鼠,同时设空白DC对照组,7d后取鼠脾细胞为效应细胞,表达mKDR的肿瘤细胞为靶细胞按100∶1、50∶1、25∶1的比例混合,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒作用。结果未经修饰DC激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对靶细胞的杀伤率为(19.6±3.7)%、(10.2±2.6)%、(6.2±2.2)%,经mRNA修饰的DC激活的CTL对靶细胞杀伤率为(75.2±2.3)%、(54.3±3.4)%、(20.9±3.1)%,同一效靶比情况下显著强于其他3组。结论hKDR(Ig1~3)mRNA致敏的DC能诱导针对Hepa1-6(mKDR)的特异性细胞免疫反应。

hKDR融合基因致敏树突状细胞对小鼠肝癌细胞杀伤活性研究

目的:探讨hKDR融合基因致敏树突状细胞(DC)激发的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对小鼠肝癌细胞的杀伤活性。方法:自小鼠骨髓中获取DC,以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和hKDR融合基因的mRNA致敏DC;用致敏的DC免疫小鼠取其脾脏获得CTL,即效应细胞,用脂质体将pCDNA hKDR转染至小鼠肝癌Hepal-6细胞株中,作为靶细胞;将效应细胞与靶细胞按不同比例混合,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒作用。结果:未经修饰的DC激活的CTL与靶细胞比例为100∶1、50∶1、25∶1情况下,其杀伤率分别为19.2%、12.3%、6.9%;经hKDR修饰的DC激活的CTL与靶细胞比例为100∶1、50∶1、25∶1情况下,其杀伤率分别为71.6%、55.8%、22.7%,将两组结果在相同的比例下两两比较,均有显著性差异(P<0.05)。结论:hKDR融合基因致敏DC激活的CTL对小鼠肝癌细胞具有较强的杀伤作用,且杀伤能力随效应细胞与靶细胞比例增高而增强。

pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)重组质粒的构建、表达及鉴定

目的:利用基因工程技术构建pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)重组质粒,为其应用于肿瘤的基因治疗奠定基础。方法:以本实验室构建保存的pcDNA3.1 hKDR为模板,PCR扩增hKDR(Ig1-3)cDNA片段后用Nco I和Xho I酶切后插入pmRNA IRES多克隆位点的相应位点中,经PCR、酶切和测序鉴定其序列正确性,然后用试剂盒体外转录出相应的mRNA,用脂质体转染COS-7细胞,经G418筛选后通过免疫组化和Western blot检测该融合蛋白。结果:PCR、酶切和测序证实pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)构建成功,体外转录出相应的mRNA,免疫组化和Western blot检测出其蛋白表达。结论:成功构建含pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)的真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用。

异种黑色素瘤相关抗原诱发抗肿瘤免疫伴发自身免疫性损伤

目的探讨腺病毒载体(Ad)介导异种黑色素瘤相关抗原酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)诱发抗肿瘤免疫与自身免疫性损伤的关系。方法用Ad编码的人或小鼠TRP2(AdhTRP2或AdmTRP2)皮内免疫C57BL/6小鼠,将小鼠分为正常对照组(d1703)、AdhTRP2和AdmTRP2免疫组。体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤试验和细胞内干扰素γ(IFNγ)染色(ICS)分析CTL杀伤活性和IFN-γ的产生(每组3只小鼠);皮下接种B16.F10黑色素瘤细胞(每组10只小鼠),观察荷瘤小鼠成活情况。结果AdhTRP2诱发小鼠CTL杀伤活性与免疫时间相关,免疫后1周活性达到最大,随后逐渐降低;AdhTRP2诱导的CTL杀伤活性具有剂量效应关系。AdhTRP2免疫小鼠1周其6hCTL杀伤率为94%±5%,脾脏产生IFNγ的CD8+T细胞占总CD8+T细胞的0.87%±0.12%,而相应地AdmTRP2分别为22%±8%和0.15%±0.05%。接种1×106B16.F10细胞,AdhTRP2免疫的小鼠观察3个月100%无瘤生长,但在病毒注射部位有白癜风形成;而接种1×105B16.F10细胞的AdmTRP2免疫小鼠3个月只有20%的成活率,并不伴局部白癜风形成。结论用Ad介导异种TRP2能有效地打破对自身TRP2的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,同时伴发自身免疫性损伤。

乳腺癌中VEGF-A/VEGF-C蛋白表达与微血管密度的关系研究

目的分析乳腺癌组织中微血管密度(MVD)与淋巴结转移的关系及VEGF-A/VEGF-C蛋白表达与MVD的关系。方法收集临床手术切除、石蜡包埋的乳腺癌标本98例、转移淋巴结42例、癌前病变7例,观察有无淋巴结转移组乳腺癌组织中微血管密度(MVD)、不同VEGF-A/VEGF-C蛋白表达情况组MVD检测结果。结果淋巴结转移组MVD明显高于未转移组,差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF-A蛋白表达与MVD呈正相关(r=0.327,P=0.000)。VEGF-C蛋白表达与MVD无相关性(r=0.123,P=0.117)。VEGF-A(+)/VEGF-C(+)组的MVD明显高于VEGF-A(-)/VEGF-C(-)组(P<0.01)。结论 VEGF-A在调控肿瘤血管生成中发挥重要作用。VEGF-A和VEGF-C在血管、淋巴管生成与癌的淋巴结转移的关系中产生协同作用。

肺癌患者血浆尾加压素Ⅱ水平的研究

目的研究肺癌患者血浆尾加压素Ⅱ水平的变化，及其与肺癌分期及不同病理类型的关系。方法采用放射免疫分析法测定肺癌患者、肺良性病变患者及对照组正常人血浆中U-Ⅱ含量。结果肺癌组U-Ⅱ血浆含量（3．537±1．198）pmol／L，与健康对照组（2．834±1．157）pmol／L以及肺良性病变组（2．922±0．924）pmol／L相比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。肺癌不同病理类型之间血浆U-Ⅱ含量比较，差异无统计学意义（P〉O．05）。Ⅰ-Ⅲ期肺癌组血浆U-Ⅱ含量明显低于Ⅳ期肺癌组（P〈0．05）。结论U-Ⅱ在肺癌血浆中的表达水平增高，且U-Ⅱ表达水平与肺癌的分期及有无远处转移有关，与肺癌的病理类型无关。

尾加压素Ⅱ在肺癌组织中的表达及其临床意义

目的检测尾加压素Ⅱ（UⅡ）在肺癌患者手术切除肺癌组织中的表达。揭示UⅡ在肺癌患者组织中的表达及其与肺癌病理类型、临床分期的相关性。方法采用免疫组织化学法观察45例肺癌组织及20例炎性假瘤中UⅡ的表达，分析UⅡ表达与肺癌病理类型及TNM临床分期的相关性。结果肺癌组织中UⅡ主要分布于肺癌细胞的细胞质中，呈棕黄色颗粒；非小细胞肺癌组UⅡ表达阳性率61．3％（19／31），与对照组肺炎性假瘤（15．0％，3／20）和小细胞肺癌组（7．1％，1／14）相比，差异有统计学意义（P〈0．01）；UⅡ在腺癌中的阳性表达率高达100％。Ⅲ期非小细胞肺癌组织中UⅡ的表达水平（85．7％）明显高于I期（16．7％）（P〈0．05）。结论UⅡ广泛存在于非小细胞肺癌尤其是腺癌细胞的细胞质中，且UⅡ表达与病理类型及TNM临床分期密切相关。