Tn5-Mob系统诱导根瘤菌属之间耐盐和共生性状的转移

本实验通过质粒pSUP5011及其辅助质粒RP4将Tn5-Mob随机插入苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti 042B)的基因组中,得到86株接合子SR。随机选取4株SR,通过辅助质粒R68.45的三亲本杂交,将它们的DNA片段引入慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium,japonicum USDA 110),获得106株接合子BSR。大部分BSR菌株获得了生长快速的特性和耐盐性,一般能耐0.3—0.5mol/L NaCl,其中有些菌株能产生黑色素。将90株BSR回接大豆和苜蓿植株,发现47株能在大豆和苜蓿植株结瘤,但在苜蓿上无固氮活性;26株只能在大豆植株结瘤固氮;13株只能在苜蓿植株结瘤而不固氮;4株在大豆和苜蓿植株均不结瘤。其中,获得了4株耐盐性和固氮酶活性强的接合子。

酶联免疫吸附技术(ELISA)对大豆根瘤菌的鉴定

本文用直接ELISA法检测大豆根瘤菌USDA 110和RTt 50的纯培养菌体和根瘤。确定了该试验的最佳工作条件:酶标结合物HRP—Ab 110和HRP—Ab50的工作稀释度分别为1:3200和1:800,抗体Ab 110和Ab 50的工作稀释度分别为1:3200和1:800,抗原USDA 110和RTt 50的最适工作浓度均为6×10~7细胞/ml。该法能够特异地检测和区别慢生型和快生型大豆根瘤菌。在这两种类型的大豆根瘤菌中,同种内的少数菌株存在交叉反应,通过吸收可以消除,从而使ELISA的检测达到菌株水平。ELISA的最低检测浓度为2×10~5细胞/ml。在冰箱低温(-20℃)和硅胶干燥常温条件下保存根瘤,均不影响ELISA的检测效果,灵敏度不降低。用ELISA研究USDA 110和RTt 50在不灭菌的盆栽土壤中的竞争结瘤能力,发现USDA 110在大豆的不同生育期的占瘤率在75—87.5%,RTt 50则为25-45%,并证实ELISA比凝集法敏感。

耐盐高效大豆根瘤菌株的构建

快生型大豆根瘤菌RT19是一株耐盐而固氮能力差的菌株,在含有0.3 mol/L NaCl的YM培养液中生长良好,代时为3.5h,甚至在0.6 mol/L NaCl条件下仍可生长。慢生型大豆根瘤菌USDA110对盐敏感,在含有0.1 mol/L NaCl的YM培养液中不生长,但结瘤固氮能力强。本实验以RT19的DNA转化USDA110细胞,在以0.3 mol/L NaCl为选择标记的YMA培养基上,挑取322个耐盐和生长快的菌落,将其中101个菌落纯化,并回接到大豆'112-2-4',得到两株耐盐、生长快而且固氮活性强的转化子RTt19和RTt50。供体菌RT19和转化子RTt19、RTt50在0.4 mol/L NaCl培养基中生长时,细胞内积累大量谷氨酸,而且丙氨酸和缬氨酸有不同程度的增长。 RTt19和RTt50经过20代的转管移植,其性状保持不变。

几种固氮菌nifA基因片段的同源性分析

参照已知数种固氮菌 nifA 基因的 DNA 序列,选择其中间区域的两个保守性较强的序列合成引物,利用肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、棕色固氮菌(Azotobacter vinela-ndii)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)和深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的总 DNA 进行聚合酶链反应,结果均扩增出约450bp大小的片段,经证实为各种固氮菌的 nifA 基因部分片段。核酸印迹分子杂交结果显示出nifA 基因在不同固氮菌中的同源性不强。

快生型大豆根瘤菌的渗透调节

弗雷德中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)RT19是快生型大豆根瘤菌。该菌株在不同浓度 NaCl 条件下,其细胞内的游离谷氨酸和钾离子含量随盐浓度的提高而急剧增加。在无盐和低浓度 NaCl 条件下,测不出细胞内有游离苏氨酸,但在较高浓度盐存在时,其含量也随着盐浓度的提高而递增。RT19在对数生长后期,突然加入 NaCl,使其培养液中的 NaCl 的最终浓度达到300mmol/L,定时取样测定细胞内氨基酸含量,发现5分钟后谷氨酸含量急剧上升,比不加盐的对照高出5倍,而且在3小时内保持不变.苏氨酸也出现类似情况。测定了 RT19及其转化子 RTt19和 RTt50的谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)在盐压下的活性,发现在300 mmol/L NaCl 或300mmol/L KC1存在时,GDH 酶活性稍为下降或不变,而 GS 和 GOGAT 酶活性则显著提高。

苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)的耐盐性研究

苜蓿根瘤菌042B 在含有400mmol/L NaCl 的基本培养基中生长时,细胞内积累大量谷氨酸。但在不含 NaCl 的基本培养基中,即使加入谷氨酸和(或)甘氨酸甜菜碱,细胞内也不积累谷氨酸。然而,在高浓度 NaCl 条件下,外源甘氨酸甜菜碱则能进入细胞内,并受到外加谷氨酸的促进。在600mmol/L NaCl 的条件下,从外源单独提供谷氰酸或甘氨酸甜菜碱,不能提高苜蓿根瘤菌的耐盐性。但是,同时加入谷氨酸(或其他氨基酸)和甘氨酸甜菜碱,则具有明显的协同效应,可以显著地减轻高盐浓度对苜蓿根瘤菌的抑制作用。钠、钾、氯和硫酸根等离子对苜蓿根瘤菌生长的抑制作用很小,但镁和硝酸根离子则严重地抑制其生长。本文还探讨了营养和苜蓿根瘤菌耐盐性的关系。