板栗外生菌根诱导基因CmNRT3的表达及功能研究

【目的】外生菌根是板栗获取土壤氮素的重要途径,但目前外生菌根对提高板栗氮素吸收和利用的分子机制尚不明确。探明板栗外生菌根诱导上调的硝酸盐转运蛋白基因CmNRT3的序列特征、表达模式及相关功能,将为外生菌根促氮吸收提供理论依据。【方法】通过转录组数据分析、荧光定量PCR、瞬时转化体系及酵母互补等方法研究CmNRT3基因的表达特征和生理功能。【结果】CmNRT3基因在板栗外生菌根中显著上调表达。在未接种板栗及苜蓿转基因根系的表皮细胞中检测到CmNRT3启动子驱动的GUS信号,而在苜蓿的丛枝菌根中,GUS信号主要存在于含有丛枝的皮层细胞中。亚细胞定位结果显示CmNRT3定位于细胞膜及苜蓿含有丛枝的细胞膜上。酵母互补试验表明,CmNRT3转运蛋白不能互补硝酸盐转运缺陷型酵母的功能。【结论】CmNRT3受外生菌根诱导表达,定位于细胞膜上。CmNRT3启动子驱动的GUS信号在含丛枝的苜蓿根系皮层细胞中强烈表达,但不具备硝酸盐吸收或转运功能。该研究为进一步揭示板栗外生菌根促氮吸收提供了理论基础。

COP9亚基FaCSN5在草莓果实发育过程中的功能分析

【目的】探究草莓COP9信号复合体亚单位5(constitutive photomorphogenic signalosome subunit 5,CSN5)在草莓果实发育过程中的功能。【方法】以草莓品种红颜为材料,根据草莓果实发育过程中的转录组数据,筛选并克隆FaCSN5基因。基于生物信息学对其功能域、理化性质、蛋白结构等进行预测。通过SDS-PAGE和Western Blot检测FaCSN5-His目的蛋白,利用烟草对其进行亚细胞定位分析。利用RT-qPCR检测FaCSN5的时空表达水平,利用农杆菌介导瞬时侵染草莓果实,观察记录表型,检测FaCSN5基因表达水平。利用圆片温育和外源激素处理试验检测外源激素对FaCSN5基因表达的诱导影响。【结果】系统进化树分析表明FaCSN5、FvCSN5和月季CSN5b同源性较高,相似率分别为100%和94.24%。克隆的FaCSN5与艳丽草莓8条基因序列的碱基和氨基酸序列相似率分别达98.97%和99.35%。FaCSN5基因的编码区为1080 bp,编码359个氨基酸,具有一个保守的MPN结构域。p ET30a-FaCSN5融合表达载体的大肠杆菌原核表达表明FaCSN5-His目的蛋白大小约66 ku。亚细胞定位显示FaCSN5-GFP融合蛋白定位为细胞核和细胞质。FaCSN5在根中表达水平最高,在种子中最低,在根中的表达量是种子中表达量的8倍;果实发育过程中在全红期表达量最高,在褪绿期表达量最低,从褪绿期开始随着果实发育表达量升高。农杆菌介导瞬时侵染草莓果实,FaCSN5过表达能够促进草莓果实成熟;沉默FaCSN5表达则会抑制草莓果实成熟。FaCSN5启动子上含有响应茉莉酸甲酯和赤霉素的顺式作用元件,且其表达受到这两种激素及脱落酸的诱导。【结论】FaCSN5可能是通过多种激素调控促进草莓果实成熟。

转录因子FabHLH148参与草莓果实的颜色发育

【目的】探究碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子在草莓果实成熟过程中的功能。【方法】基于转录组测序和基因组数据库,克隆FabHLH148基因;分析其理化性质、保守结构域、预测编码的蛋白质结构、系统进化树、亚细胞定位等;采用RT-qPCR检测其在草莓中的时空表达水平,并构建过表达(over expression,OE)和RNA干扰(RNAinterference,RNAi)载体,利用农杆菌介导瞬时侵染草莓果实,观察记录表型,检测FabHLH148表达水平,并测定花色素苷含量。【结果】FabHLH148基因CDS区全长687 bp,编码228个氨基酸,预测蛋白分子质量24.89 ku,理论等电点(pI)为11.65;该基因属于bHLH超家族,因其与二倍体草莓FvbHLH148序列相似度最高,所以将其命名为FabHLH148;亚细胞定位显示,FabHLH148主要定位在细胞核。RT-qPCR结果表明,FabHLH148在草莓不同组织部位均有表达,在果实中有较高表达并随果实成熟表达量显著升高。过表达FabHLH148能够促进果实着色以及花色素苷的积累,通过RNAi调低Fab-HLH148的表达则作用结果相反,且FabHLH148在OE组果实中表达水平显著高于对照,RNAi组果实中表达水平显著低于对照(p<0.01)。【结论】转录因子FabHLH148属于bHLH超家族,可促进草莓果实着色。

转录因子FaNAC56在草莓果实成熟中的功能分析

【目的】研究NAC转录因子FaNAC56在草莓果实成熟中的作用。【方法】根据前期果实成熟过程中的蛋白组数据,以八倍体红颜草莓为试材,克隆FaNAC56基因及其启动子。在蛋白水平,利用MEGA构建FaNAC56系统进化树,并通过生物信息学预测其编码蛋白的二级结构,以及利用烟草进行亚细胞定位;在转录调控水平,利用预测网站分析FaNAC56启动子区顺式作用元件以及下游靶基因,并通过RT-qPCR分析FaNAC56的时空表达模式。最后,利用果实圆片温育方法分析FaNAC56基因受外源激素诱导情况。【结果】FaNAC56基因全长1035 bp,编码344个氨基酸,具有NAC转录因子NAM保守结构域。系统发育分析表明FaNAC56与月季NAC56同源性最高。亚细胞定位显示FaNAC56定位于细胞核内。FaNAC56在果实中高度表达并随果实成熟表达量急剧增加。FaNAC56启动子区含有ABA、赤霉素、生长素、乙烯等激素和胁迫相关响应元件,其表达水平受这些激素诱导。靶基因分析发现FaNAC56可能响应多种激素、花色苷和蔗糖调控元件。【结论】FaNAC56可能通过多种激素调控草莓果实的发育和成熟。