凋亡分子——生命科学研究的一个新热点

马大龙，男，教授，博士生导师，中国免疫学会常务理事，《中国免疫学杂志》编委。根据国际互联网上在１９９８年１１月２４日的ＭｅｄＬｉｎｅ统计，近１０年发表有关凋亡的论文共２０５３９篇，其中近１年发表有关凋亡的论文６６６９篇，占３２．５％；而近１０年发表有...

人重组TFAR19蛋白对白血病细胞株HL-60的促凋亡效应

目的：对一种新发现的凋亡相关基因ＴＦＡＲ１９进行蛋白质水平的促凋亡效应研究，并对其作用机理进行初步的探讨。方法；利用离子交换层析对大肠杆菌表达的人重组ＴＦＡＲ１９蛋白进行纯化，将其加入到培养的白血病细胞株ＨＬ－６０，通过ＤＮＡ片段化、ＰＩ及ＡｎｎｅｋｉｎＶ标记进行流式细胞仪分析，观察ＴＦＡＲ１９蛋白的促凋亡效应。利用ＦＩＴＣ标记ＴＦＡＲ１９蛋白，分析其与细胞的结合及定位。利用Ｃａｓｐａｓｅ－３抑制剂ＤＥＶＤ－ｆｍｋ研究ＴＦＡＲ１９的凋亡信号转导途径。结果：高纯度的重组ＴＦＡＲ１９蛋白剂量依赖性地促进撤除血清的ＨＬ－６０细胞的凋亡，最高可使８２％细胞凋亡，对照为３０％。荧光标记的ＴＦＡＮ１９蛋白能与ＨＬ－６０细胞结合，主要定位于细胞核。ＤＥＶＫ－ｆｍｋ可部分抑制ＴＦＡＲ１９蛋白的促凋亡效应。结论：ＴＦＡＲ１９蛋白能够直接进入ＨＬ－６０细胞，发挥其促进细胞凋亡的效应。这一效应部分地与Ｃａｓｐａｓｅ－３的凋亡执行效应有关。

凋亡相关新基因 TFAR19 的 cDNA 克隆、表达和功能研究

利用ＲＤＡ技术从人白血病细胞ＴＦ－１中克隆成功一个与凋亡相关的新基因ＴＦＡＲ１９。序列分析表明，ＴＦＡＲ１９ｃＤＮＡ全长５５９ｂｐ，其中２５—３９９ｂｐ编码１２５个氨基酸的蛋白质。ｍＲＮＡ斑点杂交分析表明ＴＦＡＲ１９在５０种组织中均有不同程度的表达。在大肠杆菌中表达并纯化了重组ＴＦＡＲ１９蛋白质，制备了多克隆抗体，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ发现ＴＦＡＲ１９蛋白在凋亡的ＴＦ－１细胞中高表达。瞬时转染ＴＦＡＲ１９正义基因后，ＴＦ－１细胞去细胞因子后凋亡速度增加。研究表明它能抑制胃癌细胞株８０３细胞和Ｈｅｌａ细胞的生长，促进它们的去血清所致的凋亡。

TF-1细胞凋亡相关基因的研究

利用近年来发展起来的代表差异分析（ｃＤＮＡｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓａｎａｌｙｓｉｓ，ｃＤＮＡＲＤＡ）技术研究了在人红白血病细胞株ＴＦ１细胞撤除细胞因子后进入凋亡时诱导表达的基因．发现了６个新基因片段．其中有三个经与ＧｅｎＢａｎｋｎｒ和ｄｂＥＳＴ查询均没有发现同源性，已经向ＧｅｎＢａｎｋ进行登记，登记号分别为Ｕ８３２０８，Ｕ８３２７９，Ｕ８３３９７．此外还发现一批已知基因的表达与凋亡相关，其中包括Ｈｏｕ和人硫氧还原蛋白等，提示它们在凋亡中可能起作用．这项工作为进一步研究凋亡相关基因打下了良好基础．通过ＲＤＡ的研究结果，有可能发现人白血病细胞凋亡的特异标记蛋白或发挥作用的重要蛋白，以期为白血病治疗提供理论基础．

IL-10基因给药对BXSB狼疮小鼠发病的影响

目的：为了观察白细胞介素10（IL－10）在系统性红斑狼疮（SLE）发病中的作用。方法：通过基因工程方法构建了真核表达载体pcDNA3－IL－10，采用基因给药方式先后两次将质粒DNA直接肌注于3．5月龄雄性BXSB狼疮小鼠．同时给对照组小鼠注射等量空载体质粒pcDNA3。结果：发现IL－10在该鼠体内过表达可导致其血清ANA滴度、IL－6水平及肾脏IgG沉积明显增加，而尿蛋白和血清GPT水平及肾脏C3沉积无明显差异。结论：提示IL－10在SLE发病中可能具有病理性作用，阻止或减少IL－10的分泌及作用，也许有助于SLE的治疗。

人Nmi mRNA编码区存在变异形式

Ｎｍｉ基因编码一种可与Ｍｙｃ相互作用的蛋白质．在人红白血病细胞系ＴＦ－１细胞去细胞因子ＧＭ－ＣＳＦ后８ｈ，发现ＮｍｉＲＮＡ表达水平升高．利用ＰＣＲ方法从中扩增ＮｍｉｃＤＮＡ编码区，发现除正常大小的扩增片段外，还有一比公布核酸序列小约１００～２００ｂｐ的扩增片段．序列分析表明该片段为编码区第３３７～５０９位的碱基缺失，由ＧＴＴＣＣＡＴＴＧＣＧ１１个碱基取代，形成一个开放读码框架，编码２５４个氨基酸，比野生型Ｎｍｉ编码的３０７个氨基酸少５３个氨基酸．

人高血压相关基因(HRG-1)编码蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

为了研究一个新的人高血压相关基因HRG 1的编码蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性 ,使用PCR的方法扩增人HRG 1基因ORF的编码序列 ,构建了原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中诱导表达及进行体外活性鉴定。实验结果证明得到了具有生物学活性的人HRG 1原核表达蛋白。且人HRG 1原核表达蛋白具有与真核表达蛋白一致的生物学活性。

细胞因子研究进展

一、概述 机体的各种细胞能合成和分泌小分子的多肽类因子,它们调节机体的生理功能,参与多种细胞的增殖,分化和行使功能,这些因子统称为细胞因子(Cytokine).本文重点介绍与免疫有关的细胞因子.包括:1.白细胞介素(IL):包括IL-1～IL-18-2.集落刺激因子(CSF):包括Multi-CSF(IL-3).GM-CSF,C-CSF,C-CSF.红细胞生成素(Epo),干细胞因子(SCF),白血病抑制因子(Leukermia inhibitory factor,LIF),血小板生成素(Tpo)等.3.干扰素(IFN):包括IFN-a,IEN-β,IFN-γ.4.肿瘤坏死因子(TNF):包括TNT-α.TNF-β(LTα).(LTα),LT-β.5.趋化素(Chemokine):根据分子结构分为4个亚家族,包括C-X-C,C-C,C和C-X_3-C亚家族.6.生长因子(Growth factor):对细胞具有促生长作用的细胞因子.

利用cDNARDA技术研究BXSB狼疮小鼠差异表达的基因

利用近年来发展起来的代表性差异分析cDNA RDA (cDNA representationaldifferenceanalysis)技术筛选BXSB红斑狼疮小鼠发病相关基因 .发现了 3个新的表达序列标签 (EST)片段 ,在GenBank中的登录号分别为AF0 60 113 ,AF0 60 111,AF0 60 110 ,同时发现了一些已知与自身免疫病相关的基因如逆转录病毒衣壳蛋白、Line 1逆转录酶等 .通过RDA技术可能发现系统性红斑狼疮发病相关新基因 。

SLE患者PBMC中IL-6mRNA和IL-10mRNA的表达

为了进一步了解TH2型细胞因子IL-6和IL-10在系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单核细胞（PBMC）中的基因表达情况，对7例SLE患者和4例年龄相匹配对照PBMC中IL-6mRNA和IL-10MRNA表达进行了原位杂交检测，并对检测结果进行计算机图象灰度扫描分析、结果SLE患者PBMC中IL-6mRNA和IL-10mRNA均明显高表达，并与患者ANA滴度及抗（ISDNA抗体有一定的相关性尤以IL-6为著。提示IL-6和IL-10作为B细胞刺激因子在SLE发病中具有重要病理性作用，阻止或减少其分泌可能有助于SIE治疗。

人重组粒细胞集落刺激因子突变体的构建、表达和其体内外生物学活性研究

目的为提高人重组粒细胞集落刺激因子（ｈｕｍａｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ｒｈＧ－ＣＳＦ）的稳定性和活性，对ｒｈＧ－ＣＳＦ进行改造和体内、外活性研究。方法利用定向点突变技术，将人重组粒细胞集落刺激因子第１７位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列，ＤＮＡ序列分析证明后，在大肠杆菌中表达突变蛋白。利用Ｇ－ＣＳＦ依赖细胞株ＮＦＳ－６０，对在不同温度及在人血浆中保存的Ｇ－ＣＳＦ蛋白（Ｇ－ＣＳＦ－Ａｌａ１７）和野生型的Ｇ－ＣＳＦ进行活性测定。腹腔注射后小鼠外周血白细胞计数检测其体内生物学活性。结果ＤＮＡ序列分析表明１７位半胱氨酸突变为丙氨酸，并在大肠杆菌中表达成功Ｇ－ＣＳＦ－Ａｌａ１７。纯化的突变蛋白对ＮＦＳ－６０细胞具有刺激活性；与野生型Ｇ－ＣＳＦ相比，在各种温度储存的突变蛋白保留更高的活性，与人血浆孵育５０小时后突变蛋白仍保持活性；小鼠一次性体内注射突变蛋白后外周血白细胞数明显高于野生型Ｇ－ＣＳＦ。结论Ｇ－ＣＳＦ突变体（Ｇ－ＣＳＦ－Ａｌａ１７）较野生型的Ｇ－ＣＳＦ具有更高的体外稳定性和体内造血刺激活性。

利用抑制性减数杂交技术(SSH)研究IL-10抑制表达的新基因

目的 利用抑制性减数杂交 (SSH)技术筛选IL 10抑制表达的新基因。方法 以PHA刺激的U937细胞为tester,以PHA刺激同时IL 10抑制的U937细胞为driver,提取mRNA ,反转录构建cDNA文库 ,利用SSH技术筛选IL 10抑制表达的新基因。结果 通过SSH技术 ,发现了 15个可能的IL 10抑制表达的基因 ,其中 6个与GenBank中已公布的表达序列检签 (expressedsequencetag ,EST)片段没有明显同源性 ,为新基因 ,其中之一经EST拼接 ,得到全长cDNA ,为一种新的C C家族趋化因子 ,已被GenBank收录 ,收录号码为AF0 96 985。挑选 4个新基因进行Northernblot分析 ,发现IL 10可抑制其中 3个新基因表达。结论 SSH技术是一种高效的差异基因筛选方法 ,IL

一个人类凋亡相关新基因TFAR15的cDNA克隆化与表达

运用cDNA RDA(cDNA Representationaldifferencesanalysis)的方法 ,已获得了在细胞因子依赖性红白血病细胞系TF 1中撤除GM CSF(Granulocytemacrophage colonystimulatingfactor)后表达增高的多个基因片段 ,其中一个经GenBank检索为新基因 .利用RACE (rapidamplificationofcDNAends)和EST (expressedsequencetags)重叠片段拼接的方法克隆了该基因的cDNA全长序列 ,命名该基因为TFAR1 5 (TF 1cellapoptosisrelatedgene 1 5 ) .TFAR1 5全长cDNA由 1 2 1 8个碱基组成 ,其分布十分广泛 .随着GM CSF的去除 ,TF 1细胞中TFAR1 5的mRNA和蛋白表达水平均有不同程度的增高 .体外活性研究发现 ,重组TFAR1 5蛋白片段可抑制人胚肾细胞 2 93的自然凋亡 .

人重组C3片段通过IL-2自分泌效应对CTLL-2细胞产生促增殖作用

目的研究补体Ｃ３片段的体外生物学活性及其作用机理，进一步探讨Ｃ３片段与免疫细胞的关联。方法利用重组ＤＮＡ技术表达纯化Ｃ３活性片段（命名为Ｃ３３），观察其对ＩＬ－２依赖性的小鼠杀伤性Ｔ细胞株ＣＴＬＬ－２细胞的促增殖效应，并通过抗体封闭途径和分子杂交技术研究Ｃ３３作用的机理。结果发现Ｃ３３蛋白对ＣＴＬＬ－２细胞具有明显的促增殖作用，并呈剂量依赖关系；这一作用能够部分地被抗小鼠ＣＤ１１ｂ抗体所封闭，能够完全被抗小鼠ＩＬ－２抗体所封闭；分子杂交显示Ｃ３３蛋白能够明显刺激ＣＴＬＬ－２细胞的ＩＬ－２ｍＲＮＡ表达。结论人重组Ｃ３片段Ｃ３３可通过ＩＬ－２的自分泌效应对ＣＴＬＬ细胞产生促增殖作用，补体受体ＣＲ３参与这一作用。

白介素I受体拮抗剂基因治疗小鼠Ⅱ型胶原关节炎的疗效观察

目的 探讨白细胞介素I受体拮抗剂 (IL 1ra)基因治疗小鼠Ⅱ型胶原关节炎效果 ,为临床开展类风湿关节炎基因治疗奠定基础。方法 通过基因工程方法将人IL 1racDNA插入真核表达载体pcDI中 ,构建成在真核细胞内表达IL 1ra的质粒pcDI IL 1ra。经酶切、PCR和DNA测序鉴定均证实了插入片段的正确性。体外和体内转染真核细胞后 ,分别用ELISA和免疫组织化学方法检测到了IL 1ra的高效表达。将小鼠分成 4组 ,每组 8只 ,1组、2组用基因枪给药法 (2 0 μg 只小鼠 ) ,3组、4组用肌肉注射法 (2 0 0 μg 只小鼠 ) ,一次性将这一构建质粒注射于Ⅱ型胶原诱导的DBA 1小鼠关节炎模型肌肉组织中。结果 用两种方式IL 1ra基因给药后第 4天 ,小鼠肌肉组织中IL 1ra表达结果经计算机图像分析 ,吸光度 (A) 4 90值 :基因枪组为 0 5 2± 0 0 3,肌注组为 0 4 8± 0 0 2 ,对照组 0 4 1± 0 0 2。基因枪组与于对照组比较P <0 0 1,肌注组与对照组比较P <0 0 5。给药后第 6天和第 12天 ,小鼠血清IL 1ra水平 ,与对照组比较基因枪组于第 6天和第 12天均显著升高 (P <0 0 1)。肌注组小鼠血清IL 1ra水平在第 6天和第 12天也显著高于对照组 (P <0 0 1,P <0 0 5 )。两种治疗组的小鼠病情从第 6天开始缓解 ,关节红肿较对照组减轻。

人肺癌相关抗原的基因克隆

目的克隆人肺癌相关抗原的基因。方法用λｇｔ１１Ｓｆｉ－Ｎｏｔ定向克隆载体构建人肺鳞癌细胞系Ｌ－７８的ｃＤＮＡ文库，并以抗人肺癌单抗ＡＬＴ－０４为探针进行了筛选。对名为ｈｌｃ－１４的ｃＤ－ＮＡ克隆作了测序分析与进一步研究。用重组的ｐＸＪ４１－ｈｌｃ１４质粒转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，通过免疫组化法对克隆基因进行了表达检测与鉴定，还观察了转染细胞的软琼脂集落形成能力。结果建成１．４×１０６ｐｆｕ／ｍｌ人肺癌ｃＤＮＡ文库，经过四轮免疫学筛选获得６个ｃＤＮＡ克隆，最大的ｃＤＮＡ克隆为ｈｌｃ－１４，长９５４ｂｐ。对该克隆的测序结果与基因库资料比较，未发现同源序列。ｈｌｃ－１４ｃＤＮＡ转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞有明显的肺癌相关抗原表达，并且在软琼脂中的集落形成能力增强。结论ｈｌｃ－１４是一个新的肺癌相关抗原的ｃＤＮＡ序列。这一序列的发现为阐明肺癌的发病机理。