肾癌相关基因克隆——肾癌cDNA消减文库的构建

应用抑制性消减杂交技术 ,构建人肾癌与正常肾差异表达的cDNA消减文库 .分别从肾癌及正常肾细胞系中提取 poly (A) +RNA ,依次合成单链及双链cDNA ,经酶切成平均大小为 4 0 0～ 60 0bp的片段 ,将肾癌cDNA分为两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与正常肾cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR后 ,将产物与T/A载体连接构建成功cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 .构建成功具有高消减效率的人肾癌cDNA消减文库 ,非特异性cDNA片段被有效地消减 ,特异表达的cDNA得到富集 .文库扩增后得到 650 0个克隆 ,随机挑取 3 50个制备质粒 ,酶切分析均得到 4 0 0～ 60 0bp插入片段 .所构建的人肾癌cDNA消减文库为进一步大批量筛选。

Wnt/Frizzled信号传导通路在肾癌细胞系的表达

对Ｗｎｔ５Ａ，Ｗｎｔ５Ａ受体Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５（ｈＦｚ５）及其信号传导系统下游成分──致癌性β－连环蛋白（β－ｃａｔｅｎｉｎ）在肾癌细胞系 ＧＲＣ－１中表达的变化进行了观察．半定量ＲＴ－ＰＣＲ结果表明 ＧＲＣ－１细胞系中Ｗｎｔ５Ａ和ｈＦｚ５的ｍＲＮＡ水平明显高于正常肾细胞系，这一发现被原位杂交结果证实．进一步的研究发现β－连环蛋白ｍＲＮＡ水平在ＧＲＣ－１细胞系无明显改变，但Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析观察到胞浆中β－连环蛋白的含量明显高于正常肾小管细胞（Ｐ＜０．０１）．应用特异性免疫细胞化学和ＳＳＣＰ等技术发现，ＧＲＣ－１细胞中β－连环蛋白的高表达是由Ｗｎｔ５Ａ／ｈＦｚ５高表达引起的，而不是该传导系统中结肠腺性息肉基因（ＡＰＣ）和β－连环蛋白基因突变的结果．上述结果提示：原癌基因Ｗｎｔ及其受体的高表达可能是ＧＲＣ－１细胞恶性增生的原因之一。

β-环连蛋白在肾癌中的表达

目的 探讨β环连蛋白在肾癌发生发展过程中的作用。 方法 采用免疫组织化学方法对２６ 例肾癌患者手术标本进行研究。 结果 癌组织细胞胞浆内β环连蛋白表达明显较正常组织内高，而且与肾肿瘤的临床分期有关，肿瘤分期越高，癌细胞内β环连蛋白的表达也越强，ｐＴ３ 和ｐＴ４ 肿瘤较ｐＴ１ 和ｐＴ２ 肿瘤表达明显增加（ Ｐ＜ ０ ．０１） 。 结论 细胞内β环连蛋白表达的增加与肾癌的发生发展有关，而且可能是肾癌形成和发展的重要机制之一。