免疫抑制剂检测策略的研究进展

免疫抑制剂是一类能够抑制移植排斥反应,维持器官移植术后患者健康的药物。由于治疗窗口窄、毒副反应大,个体差异大等特点,免疫抑制剂已成为重要治疗药物监测项目。然而临床上面临药物浓度结果与药效相关性不佳、侵入性操作风险等问题,限制其发展。随着相关研究发展,越来越多新检测策略出现,如游离药物浓度、干血斑、唾液检测等,进一步推动免疫抑制剂检测向着准确、便捷、低风险的方向发展。该文总结了免疫抑制剂各类检测策略的研究进展,为临床选择提供参考。

临床质谱实验室发展中的机遇与挑战

质谱技术凭借其高灵敏度、高特异性、可同时检测多个化合物等优势,备受临床检验专家的关注并广泛应用于临床检验实验室。近年来,质谱技术在病原微生物鉴定,微量元素及重金属、小分子激素、维生素、氨基酸、多肽和蛋白质的检测,治疗药物监测以及中毒物质筛查等领域不断取得重要成果。为深入探讨质谱技术进入临床实验室所带来的机遇和挑战,中华检验医学杂志特邀来自检验医学领域的知名专家,围绕质谱技术在临床实验室中的定位、质谱技术对临床实验室的发展和改善、质谱检测结果解读面临的挑战、临床质谱实验室运营管理面临的挑战以及临床质谱实验室改进方法等议题发表他们的经验和看法。专家们一致认为,质谱技术的引入为临床实验室和科研带来了新的发展方向和机遇,同时也面临样本前处理难度大、质谱技术成本高且操作复杂、数据处理和解读复杂、标准和规范的缺乏及质谱收费问题等一系列挑战。

基于重组酶介导的等温扩增和CRISPR-Cas13a检测幽门螺杆菌的方法的建立

目的开发一种基于重组酶介导的等温扩增(RAA)和成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白(Cas13a)系统的幽门螺杆菌核酸检测体系。方法选取2021—2022年于应急总医院收集的30株幽门螺杆菌以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌各2株。针对幽门螺杆菌UreC基因保守区序列,设计RAA-Cas13a核酸检测体系所需的特异性引物及CRISPR RNA(crRNA)。再通过琼脂糖凝胶电泳筛选出产生非特异性产物最少的引物对,并应用Cas13a切割荧光探针产生的荧光强度筛选出切割效率最高的crRNA序列,构建了RAA-Cas13a核酸检测体系,通过检测梯度浓度稀释的幽门螺杆菌ATCC 43504基因组DNA以及5种不同的临床常见病原体基因组DNA,评价基于RAA-Cas13a核酸检测体系的最低检测限及特异性。通过RAA-Cas13a核酸检测体系与已建立的荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法同时检测临床菌株,得到该方法与qPCR方法的一致性。采用双侧配对t检验对两组间的荧光值进行比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果建立的RAA-Cas13a核酸检测系统可以在1 h内检测出低至10拷贝/μl的靶标DNA(t=11.05,P<0.01),且与其他5种临床常见菌株无交叉反应。RAA-Cas13a方法与传统的qPCR方法具有良好的一致性,Kappa系数为1。结论建立了一种将RAA与CRISPR-Cas13a结合进行幽门螺杆菌检测的方法,可用于快速且灵敏的识别幽门螺杆菌感染。

肾素前体和成熟肾素的原核表达及纯化

目的原核表达及纯化肾素前体(renin,REN)和成熟肾素(REN-340),并检测其浓度。方法根据NCBI中检索获得的人REN基因序列(5972),经E.coli密码子优化后,人工合成REN及REN-340基因片段,克隆至载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒6×His-REN-p ET和6×His-REN-340-p ET。转化至感受态E.coli BL21(DE3),于不同诱导温度(20、25、30、37℃)及不同终浓度(0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L)IPTG条件下进行诱导表达。采用最佳诱导条件诱导表达重组REN和REN-340,经Ni-NTA镍离子亲和层析后,ELISA法检测其浓度。结果经双酶切及测序鉴定,重组表达质粒6×His-REN-p ET和6×His-REN-340-p ET构建正确。重组REN和REN-340的最佳诱导温度分别为37和20℃,最佳IPTG终浓度分别为0.1和0.2 mmol/L。纯化的重组REN和RNE-340浓度分别为9148.21和15115.31 m IU/m L。结论制备的重组REN和REN-340蛋白浓度较高,且生产周期较短,有望用于制备室间质量评价(external quality assessment,EQA)的候选质控品和标准物质。

新型冠状病毒核酸血液筛查系统的检测性能评价

目的采用假病毒对三种新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)核酸血液筛查试剂的检测性能进行比较和分析,为SARS-CoV-2核酸血液筛查的试剂选择提供依据。方法使用慢病毒包装系统构建包含SARS-CoV-2基因组片段的假病毒。使用A、B、C三个单位的SARS-CoV-2核酸血液筛查系统进行RNA提取和扩增,根据各试剂检测结果计算其检测限(limit of detection,LoD)、特异度和精密度。结果A、B、C三个单位N区段的单检LoD分别为3.46、8.73、23.87 copies/mL,混检LoD分别为13.65、78.92、159.14 copies/mL。ORF1ab区段的单检LoD分别为6.32、12.22、24.05 copies/mL,混检LoD分别为26.94、67.97、94.80 copies/mL。各试剂检测SARS-CoV-2阴性血浆的特异度均为100%,检测2LoD和较高浓度假病毒的批内和批间变异系数均小于5%。结论A公司的SARS-CoV-2核酸血筛系统灵敏度最高。三种试剂均有良好的特异度和精密度。

我国OBI献血者中乙型肝炎病毒BCP/前C区及C区的分子特征

目的获得我国隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult HBV infection,OBI)人群中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基本核心启动子区(basic core promoter,BCP)、前C区和C区序列特征,为进一步阐明该区域与OBI的关系奠定基础。方法收集2016—2018年全国18个省、自治区和直辖市的43家血站实验室,经日常检测后HBV DNA阳性的血浆样本。经实验室确认后HBsAg阳性样本和OBI样本各入组不少于200例,针对HBV BCP/前C区、C区和S区进行半巢式或巢式PCR和Sanger测序及序列分析。结果完成测序417例样本,其中HBsAg阳性样本216例和OBI阳性201例,均为基因型B和C。HBsAg阳性组该区域的突变频率明显高于OBI组。在B基因型中仅发现1个OBI高频突变A1896G,在C基因型中发现T1762A/A1764G、T1803A/G、A1986G、T1866A(D22E)等OBI高频突变。在C基因型中发现的前C区ε-反式作用元件区域(1847-1907 nt)突变G1888T可能会改变前基因组RNA的茎环结构,从而影响其的转录。此外,还在OBI组首次发现了BCP区1756-1775 nt缺失突变,可能会直接影响HBsAg和HBeAg的表达,从而导致OBI的发生。结论本研究深入分析了我国OBI献血者中BCP区、前C区、C区的序列基本特征,发现HBsAg阳性组该区域突变频率显著高于OBI组,TA缺失突变和G1888T可能会导致OBI的发生。

基于基因工程蛋白重组技术高效制备降钙素原参考物质的方法及应用

目的构建人降钙素原(hPCT)原核表达载体, 低成本、快速、高浓度、高纯度获取hPCT纯化蛋白, 为临床实验室检测制备质控品和参考物质奠定基础。方法将GenBank提供的hPCT编码序列经大肠杆菌密码子优化后, 人工合成DNA片段克隆至pET-28a(+)原核表达载体以构建重组hPCT表达质粒。转化至大肠杆菌E. coli BL21感受态中, 优化诱导表达条件、诱导质粒表达并对重组蛋白进行His融合标签纯化。结果成功构建重组hPCT原核表达质粒, 优化异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达浓度及诱导温度, 最适IPTG浓度为0.2 mmol/L, 最佳诱导温度为37 ℃。纯化后hPCT蛋白可通过临床检测, 且稀释倍数与检测浓度间呈现良好线性关系, 回归方程为y=-0.0085x+112.63, R2值为0.9975。结论成功构建重组hPCT的高效表达系统, 重组hPCT蛋白纯度大、浓度高、生产周期短, 有成为候选室间质量评价参考物质的潜力。