重组人神经生长因子的高效表达和生物活性评价研究

目的利用中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)细胞真核表达系统,获得高产的人神经生长因子(recombinant human Nerve Growth Factor,rhNGF)表达细胞株并对其分泌的rhNGF生物学活性进行评价。方法设计、合成并构建了携带rhNGF目的基因的GS-DHFR双基因筛选表达载体pDG2.0/NGF。经脂质体转染法将其导入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO DG44)中,经氨甲喋呤(MTX)和蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)两种药物加压筛选和克隆化获得目的细胞株。经过阳离子交换和分子筛纯化,获得rhNGF制品。最后,利用小鼠神经生长因子生物学活性参比品评估纯化制品的生物学活性。结果通过基因合成、载体构建、细胞转染、加压筛选和克隆化等步骤,我们得到了高表达rhNGF的CHO-DG44单克隆细胞株。经过2步法纯化获得了纯度大于98%的精制rhNGF制品。生物学活性分析表明,与市售小鼠NGF产品相比较,我们所表达的rhNGF具有更好的生物学活性。结论成功实现了rhNGF的高水平和高活性表达,为大规模工业化生产重组人神经生长因子奠定了坚实基础。

供血浆者人巨细胞病毒中和抗体的流行病学调查

目的了解我国山东、安徽及黑龙江省部分地区供血浆者人巨细胞病毒中和抗体效价的流行病学状况,为人巨细胞病毒特异性免疫球蛋白的研制提供科学依据。方法采用微量细胞病变中和试验方法,检测794份供血浆者血浆人巨细胞病毒中和抗体效价水平。结果 794份健康人血浆巨细胞病毒中和抗体效价主要分布在1∶8~1∶64,约71.7%供血浆者HCMV中和抗体效价高于1∶8;其中效价≥1∶181占0.38%,效价≥1∶45约占15%。结论通过筛选高中和效价血浆制备人巨细胞病毒特异性免疫球蛋白切实可行。

神经生长因子依赖的TF-1亚克隆细胞株的筛选及应用

目的筛选神经生长因子(nerve growth factor,NGF)依赖的TF-1亚克隆细胞株,用于重组人NGF(rhNGF)生物学活性的测定。方法逐步将含重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophagecolony stimulating factor,rhGM-CSF)的培养基替换为含鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor,mNGF)的培养基,将rhGM-CSF依赖的TF-1细胞驯化为mNGF依赖的TF-1细胞;绘制mNGF依赖的TF-1细胞的剂量-效应反应曲线,计算信噪比(S/N)和细胞最大效应(maximal effect,Emax)区间;用甲基纤维素半固体培养基对mNGF依赖的TF-1细胞进行克隆化,镜下挑选单克隆细胞,扩大培养,绘制各单克隆细胞株对NGF的剂量-效应反应曲线,并对其中反应性最好的单克隆细胞株进行STR图谱鉴定;对细胞接种密度和培养时间进行优化;用筛选出的细胞检测rhNGF的生物学活性。结果经驯化,rhGM-CSF依赖的TF-1细胞可在只含mNGF的培养基中正常生长,并对NGF的刺激呈良好的剂量-效应反应关系;驯化后的mNGF依赖的TF-1细胞对mNGF的剂量-效应曲线的信噪比为2.0,Emax为0.43;共筛选出15株细胞形态良好、倍增时间稳定的单克隆细胞株,其中A2亚克隆细胞株(TF-1-A2)反应性最好;该细胞中未发现人类细胞交叉污染现象,仅在CSF1PO位点与ATCC TF-1细胞数据有差异,可判定为TF-1细胞;细胞接种密度为5×104个/ml、培养时间为72 h时对rhNGF有良好的反应性,可用于rhNGF生物学活性的检测。结论成功筛选出1株对NGF具有良好反应性的TF-1-A2亚克隆细胞株,可用于定量检测NGF的生物学活性。