载体介导的RNA干扰技术抑制肝癌细胞中糖原合成酶激酶3β表达的研究

目的构建和筛选能高效、特异性抑制人GSK-3β基因表达的siRNA表达载体,探讨其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法提取人L02细胞总RNA,RT-PCR扩增GSK-3β基因序列,克隆至pSEB-HUS真核表达载体,构建pSEB-G重组质粒。将设计、合成的3条靶向GSK-3β基因编码区的siRNA及阴性对照分别克隆至pSEB-G,构建siRNA表达载体pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G及pSEB-siN-G。将siRNA表达载体瞬时转染HepG2细胞,通过绿色荧光信号、RT-PCR和Western blot观察和检测其对GSK-3β基因的抑制效果,MTT实验和caspase-3活性分析检测其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。结果经双酶切及测序证实,所构建si RNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。瞬时转染HepG2细胞后,其中的pSEB-si1-G能使细胞中绿色荧光信号明显减少,可显著抑制GSK-3βmRNA的表达及蛋白的合成,并使HepG2细胞增殖明显降低,caspase-3活性显著升高。结论成功构建了靶向GSK-3β基因的siRNA表达载体,沉默GSK-3β能显著抑制HepG2细胞的生长并诱导其发生凋亡。

红景天苷对自然衰老小鼠模型的抗衰老作用研究

目的通过检测红景天苷对自然衰老小鼠模型不同器官组织抗氧化酶活性及过氧化脂质水平的影响,探索红景天苷在老龄动物体内可能的抗衰老作用机制。方法使用不同剂量(0.2g/kg和1.0g/kg)的红景天苷给16月龄自然衰老小鼠灌胃60d后,检测小鼠血清、心脏、肝脏、肾脏和大脑等各器官组织匀浆中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶的活性及过氧化脂质和脂褐素的水平。以人参皂苷为阳性药物。结果与未加药对照组相比,红景天苷高剂量给药组自然衰老小鼠的血清、心脏、肝脏及肾脏的超氧化物歧化酶活性显著提高,而血清、肝脏、肾脏中过氧化脂质水平显著下降。该高剂量给药组自然衰老小鼠的心脏、肝脏、肾脏和大脑中脂褐素水平均较对照组降低,其中尤以大脑中的脂褐素水平降低最为显著。此外,高剂量红景天苷给药组小鼠的肾脏和大脑中谷胱甘肽过氧化酶活性与对照组相比出现一定程度的升高。结论红景天苷能够有效提高自然衰老小鼠体内不同器官组织的抗氧化酶活性并且降低过氧化脂质和脂褐素水平,从而起到延缓衰老的作用。不同脏器组织对药物的反应性存在一定差异。

西多福韦对人宫颈癌细胞CaSki内人乳头瘤病毒16抑制作用研究

目的从抗病毒角度探讨西多福韦对宫颈癌细胞CaSki内人乳头瘤病毒16(HPV16)的抑制作用及对细胞周期的影响。方法用MTT法检测西多福韦对细胞的毒性;用实时定量PCR法检测其对病毒E6、E7 mRNA水平的影响;用Western blot方法检测其对病毒蛋白E6、E7和细胞抑癌蛋白p53、pRb表达水平的影响;用流式细胞法检测其对宫颈癌细胞周期的影响。结果西多福韦对宫颈癌细胞毒性较正常细胞大。可使HPV16阳性宫颈癌细胞CaSki内E6、E7 mRNA和蛋白水平降低,最大抑制率分别为(33.38±8.00)%、(28.32±2.73)%和98.92%、97.46%;可以使p53、pRb蛋白水平升高,最大浓度时可以上调12.06和3.53倍;对HPV16阴性宫颈癌细胞C-33A p53蛋白表达无影响,但可提高pRb蛋白水平;可导致CaSki和C-33A细胞发生S期阻滞,最高浓度组细胞相对对照组S期分别增加22.83%和67.64%。结论西多福韦可以在对细胞无毒的浓度下,抑制宫颈癌细胞内的HPV16,诱导宫颈癌细胞发生S期阻滞。

红景天苷调节人成骨肉瘤细胞MG63成骨分化及相关信号的研究

目的探讨红景天苷对人成骨肉瘤细胞株MG63诱导成骨分化作用及相关分子机制。方法 MTT法测定不同浓度红景天苷对MG63细胞增殖活力的影响;PNPP法检测经红景天苷处理后成骨性标志物——碱性磷酸酶活性的变化;RT-PCR检测细胞内bmp2 mRNA水平的变化;Western blot及流式细胞术检测给药前后细胞内BMP2、IκBα蛋白表达水平的变化。结果红景天苷能显著促进MG63细胞的增殖并上调其ALP活性,其对ALP活性的上调呈现一定的时间和剂量依赖性,其中在5μmol/L、48 h条件下表现出最佳效果,证明红景天苷具有促成骨分化作用。此外,红景天苷能显著上调细胞内bmp2 mRNA及蛋白表达水平,并能时间依赖性激活IκBα,抑制NF-κB活性。结论红景天苷能促进人成骨肉瘤细胞成骨分化,具有潜在的骨代谢调节作用,其作用机制可能与抑制NF-κB活性并激活BMP2信号通路有关。

以p53为靶点的新型抗肿瘤化合物细胞筛选模型的构建与应用

目的构建含有p53蛋白结合位点的p21或survivin基因启动子区的荧光素酶报告基因重组质粒,并获得稳定转染的细胞模型用于抗肿瘤化合物筛选。方法将含有p53蛋白结合位点的p21或survivin启动子区序列连接到pGL4.17-basic载体上,分别获得报告基因重组质粒pGL4.17-p21和pGL4.17-survivin;将两种重组质粒分别转染A549细胞,经G418筛选获得稳定转染细胞株A549-p21和A549-survivin;对该细胞模型进行条件优化,并将可调节p53蛋白表达的多种抗肿瘤药物作用于稳定转染细胞,通过荧光素酶检测和western blot方法验证细胞模型用于药物筛选的可行性。结果成功建立了分别含有p21或survivin启动子报告基因的A549-p21和A549-survivin稳定细胞模型,多种抗肿瘤药物作用该细胞后能够通过调节p53蛋白表达而影响报告基因荧光素酶活性。结论构建的稳定转染细胞模型可以用于筛选以p53为靶点的抗肿瘤化合物。

注射用脑蛋白水解物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞增殖与MPP^+诱导的氧化损伤的影响

目的探究注射用脑蛋白水解物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞增殖与1-甲基-4-苯基吡啶(MPP^+)诱导的细胞氧化损伤的影响,为建立评价脑蛋白水解物活力检测方法提供科学依据。方法通过MPP^+损伤PC12细胞后,采用MTT法测定不同厂家、不同浓度的注射用脑蛋白水解物对PC12细胞的修复作用,通过测定其吸光度与正常细胞吸光度的比值来计算样品对PC12细胞损伤的修复率,以此作为注射用脑蛋白水解物活力考察的指标。同时还对注射用脑蛋白水解物对于MPP^+损伤的不同亚型的PC12细胞作用进行了研究。结果注射用脑蛋白水解物作用时间为48 h、浓度为60μg/ml时对MPP^+诱导的PC12细胞的氧化损伤具有较好保护作用,并且对低分化型的PC12细胞具有更明显的保护作用。结论注射用脑蛋白水解物可促进低分化型PC12细胞的增殖,并减轻MPP^+的损伤作用。研究建立的活力测定方法已经被国家标准采纳。

红景天苷对力达霉素诱导人二倍体成纤维细胞衰老的干预作用

目的:研究红景天苷对力达霉素导致DNA损伤后所诱导的细胞衰老的调节作用。方法:采用MTT法测定药物对人胚肺二倍体成纤维细胞2BS活力的影响;衰老相关的β-半乳糖苷酶染色法观察细胞衰老形态变化;流式细胞术检测细胞周期分布以及γ-H2AX蛋白表达变化;蛋白免疫印迹技术观察p53和p21蛋白表达水平变化。结果:较低浓度(低于0.1 nmol.L-1)力达霉素能够抑制2BS细胞增殖,诱导β-半乳糖苷酶染色率显著升高和G2/M期阻滞,并使DNA损伤相关的γ-H2AX蛋白以及p53和p21蛋白表达升高。红景天苷能够显著干预力达霉素诱导的上述细胞衰老样表型及相关分子信号变化。结论:红景天苷能够抑制基因毒药物所致DNA损伤及其诱导的细胞衰老。

哇巴因诱导MCF-7自噬作用与机制探讨

目的探讨哇巴因诱导人乳腺癌细胞MCF-7发生自噬的作用以及分子机制。方法 MTT法和克隆形成实验测定哇巴因对MCF-7细胞增殖活力及克隆形成能力的影响,吖啶橙染色结合荧光显微镜及流式细胞术观测细胞内形态的变化及FL3/FL1荧光强度比值,蛋白质印迹法检测细胞内抗微管相关蛋白1轻链3(Light chain 3,LC3)-Ⅱ及p62蛋白表达水平的变化,流式细胞术检测细胞内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平的变化。结果哇巴因处理MCF-7细胞24h后半数抑制浓度(IC50)为(37.1±9.0)nmol/L。25nmol/L哇巴因处理12、24、48和72h后细胞存活率组间F=12.787,P<0.001;与对照组比较差异均有统计学意义,P值均<0.01。哇巴因处理2周后给药组较对照组相对克隆形成率降至(6.03±1.51)%,差异有统计学意义,F=635.800,P<0.001。吖啶橙染色及蛋白质印迹结果显示,经25nmol/L哇巴因处理48h后,胞质中出现呈亮红色荧光的酸性囊泡,并伴随LC3-Ⅱ呈时间依赖性的蓄积及p62表达的下降;在12、24和48h时,相对FL3/FL1比值组间F=62.226,P<0.001;与对照组比较差异均有统计学意义,P值均<0.05。哇巴因能同时引起细胞内ROS水平呈时间依赖性升高;0.5、1、2、4、6、12和24h时ROS水平组间F=112.901,P<0.001;与对照组比较,除0.5h组差异无统计学意义外,其余各组均差异有统计学意义,P值均<0.05;给药同时使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)后,联合给药组较给药组相对ROS水平降低至(101.2±17.5)%,与给药组比较差异有统计学意义,F=185.870,P<0.001;并且LC3-Ⅱ表达水平随之下降,而IC50值增加为(81.4±4.5)nmol/L,差异有统计学意义,F=57.610,P<0.01。结论哇巴因能够诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生自噬,其作用机制可能与促进细胞内ROS生成有关。