2023年γδT细胞肿瘤治疗领域重大进展

γδT细胞是一类表达γδTCR异源二聚体的特殊固有免疫T细胞。过去,缺乏对其全面系统的基础研究,在其发育、分化、增殖、活化、效应和耗竭等所有环节仍有很多问题尚不清楚。然而,因为成熟的γδT细胞优势定植于皮肤、消化道、呼吸道、生殖道等肿瘤高发的黏膜组织,能以MHC非限制性的方式直接识别和杀伤多种肿瘤细胞,在肿瘤免疫治疗领域具有不可替代的优势,近年来其应用异军突起,发展迅速,也因此反过来促进了基础研究的深入,取得了一些亮眼的进展。本文对2023年γδT细胞在肿瘤免疫治疗领域的重大进展进行述评,主要集中在γδT细胞肿瘤抗原识别机制、肿瘤微环境中γδT细胞的功能调控、γδT细胞抗肿瘤细胞毒活性的机制、新型基于γδT细胞的肿瘤免疫治疗协同增效策略四个方面,以期推动γδT细胞在肿瘤免疫治疗领域的进一步发展,为临床γδT细胞应用协同增效的策略提供新的思路。

靶向BCMA的CAR-γδT细胞抗多发性骨髓瘤的疗效

目的构建靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体γδT细胞(BCMA CAR-γδT),在体外初步评价其抗多发性骨髓瘤的疗效。方法构建包含BCMA单链抗体序列的三代CAR分子的慢病毒载体,瞬时转染293T细胞,荧光显微镜和Western blot验证外源基因的表达情况;包装慢病毒,用流式细胞术测定病毒滴度;分别感染人外周血αβT细胞和γδT细胞,检测感染效率;LDH法检测BCMA CAR-γδT细胞对人多发性骨髓瘤细胞系的体外细胞毒活性,并用Incucyte实时细胞分析系统比较BCMA CAR-γδT细胞与BCMA CAR-T细胞的细胞毒活性差异。结果将BCMA-CAR慢病毒载体转入293T细胞24 h后,荧光显微镜观察到外源ZsGreen的表达;Western blot检测CD3ζ证明BCMA-CAR能顺利表达。慢病毒包装后,收集感染上清浓缩,测得病毒滴度为2.23×10^(8)Tu/mL。用MOI=5感染人外周血αβT细胞与γδT细胞,流式检测结果显示αβT细胞感染效率为59.18%±2.56%,γδT细胞感染效率为48.15%±9.86%。LDH杀伤实验结果显示,CAR-γδT细胞对BCMA高表达的人骨髓瘤细胞系MM1.S、H929和过表达BCMA的K562细胞的细胞毒活性较空载体对照γδT细胞显著增强(P<0.001),而对BCMA表达阴性的细胞系无差异;活细胞时程分析系统结果显示,BCMA CAR-γδT细胞与BCMA CAR-αβT细胞在体外对H929的细胞毒活性均显著优于其空载体对照细胞,且均对BCMA表达阴性的细胞系的细胞毒活性无差异。结论BCMA CAR-γδT细胞在体外显示出明显增强的靶向BCMA的细胞毒活性,有望作为新型同种异体γδT细胞产品,用于多发性骨髓瘤的细胞过继免疫治疗。

过表达膜定位IL-3的293T细胞外泌体的纯化及体外功能验证

目的体外验证过表达膜定位IL-3的293T细胞外泌体的功能,为在阿尔茨海默病模型动物的体内功能验证奠定基础。方法利用本课题组的专利结构,构建能定位于外泌体膜上的重组IL-3慢病毒载体,包装病毒感染293T细胞,筛选稳定表达细胞株。用流式细胞测量术和免疫荧光技术对IL-3的膜定位进行验证;超滤离心纯化IL-3外泌体,透射电镜观察外泌体形态;纳米流式测量术检测外泌体粒径分布及浓度;Western blot检测IL-3及外泌体相关标志蛋白质表达;免疫荧光技术检测其对小胶质细胞系BV-2吞噬Aβ淀粉样蛋白能力的影响。结果经过载体构建、病毒感染、嘌呤霉素筛选和验证,得到稳定过表达膜定位IL-3的293T细胞株;收集纯化外泌体,在透射电镜下可见直径50~100 nm的双层膜囊泡结构;免疫印迹结果显示CD63、ALIX、TSG101等多种外泌体标志蛋白质检测阳性,且与对照相比富含IL-3,提示IL-3外泌体纯化成功;免疫荧光技术检测结果显示IL-3外泌体能在体外促进BV-2细胞对Aβ淀粉样蛋白的吞噬作用。结论过表达膜定位IL-3的基因修饰293T细胞外泌体在体外兼具IL-3和外泌体的作用,能够促进小胶质细胞的吞噬作用,为阿尔茨海默病的临床治疗提供新的思路。

IL-2受体信号转导及其功能研究进展

IL-2是最早发现的细胞因子之一．又称T细胞生长因子（Tcellgrowthfactor，TCGF），对T细胞的增殖、发育和分化具有重作用。有研究报道IL-2不仅可以促进T细胞的生长发育．还可促进其凋亡。IL-2还是细胞毒性T淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK）和B淋巴细胞重的生长和激活因子。对于该分子的研究可以追溯到1976年，

BCSC-1基因异位表达致鼻咽癌细胞CNE-2L2黏附性增强及细胞周期阻滞

目的探讨BCSC-1基因异位表达导致人鼻咽癌细胞CNE-2L2恶性行为减弱的机制。方法采用碘化丙啶染色DNA,流式细胞法检测细胞周期;Hoechest33258染色分析细胞分裂情况;细胞聚集实验检测细胞的黏附性;Western印迹分别检测E-钙黏蛋白、α-catenin和p53的表达。结果细胞周期分析显示异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞、野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞分别有55.1%、43.4%和39.4%处于G0/G1期,分别有25.2%、28.7%和30.9%处于S期,分别有19.7%、27.9%和29.7%处于G2/M期。野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞有较多细胞处于有丝分裂相,异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞几乎见不到有丝分裂相。异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞的黏附性和E-钙黏蛋白、α-catenin及p53的表达水平均高于野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞。结论异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞的黏附性增强可能与E-钙黏蛋白和α-catenin表达增强相关;异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞阻滞于G1期可能与p53表达增加相关。这些变化可能在细胞恶性行为减弱中发挥作用。

ULBPs及MIC分子在亚健康状态诊断及评价中的作用

目的建立亚健康状态人群ULBPs和MICA/B分子表达数据库,分析它们作为亚健康状态的具体参考指标的可能。方法用体检和问卷调查的方法对志愿者进行筛查,用酶联免疫技术检测血清中ULBPs和MICA/B含量。结果亚健康组的MICA、MICB、ULBP1和ULBP2的含量均高于健康对照组,而ULBP3、ULBP4和ULBP5低于健康对照组。亚健康组和健康组之间只有MICB有显著性差别(P<0.01)。另外,男性MICA和ULBP3的平均值显著高于女性。而ULBP2和ULBP4会随着年龄的增长呈现上升趋势。结论亚健康组的血清MICB含量明显升高,它可以联合其他免疫指标一起作为诊断亚健康的一种辅助手段。

人α-甘露糖苷酶Man2c1转基因对移植性肿瘤在小鼠体内生长和转移的影响

目的研究人α-甘露糖苷酶(hMan2c1)转基因对小鼠移植性肿瘤生长、转移的影响。方法接种肝癌细胞H22或肉瘤细胞S180于野生型ICR小鼠和3个系的转基因小鼠(28、35和54号)右侧腋窝皮下,连续测量肿瘤体积。分别于接种细胞第9天和第10天处死小鼠,称重肿瘤。分别对肿瘤组织和肺组织进行HE染色。用Tris-NH4Cl破碎脾脏中的红细胞,以Yac-1细胞为靶细胞,检测脾脏中自然杀伤(NK)细胞的活性。结果接种于3个系的转基因小鼠的H22肿瘤或S180肿瘤的体积及重量均显著高于野生型小鼠(P<0.05)。绝大多数转基因小鼠的肿瘤向周围组织侵袭,而野生型小鼠的肿瘤几乎均有包膜。54、35和28号转基因小鼠的H22肿瘤肺转移率分别为30%(3/10)、50%(5/10)和30%(3/10),野生型小鼠的肿瘤肺转移率为10%(1/10);54、35和28号转基因小鼠的S180肿瘤肺转移率分别为16.7%(1/6)、50%(3/6)和33.3%(2/6),野生型小鼠的肿瘤肺转移率为0(0/10)。转基因小鼠脾脏的NK细胞活性与野生型小鼠比较差异无显著性(P>0.05)。结论hMan2c1转基因促进移植性H22肿瘤及S180肿瘤在ICR小鼠的生长、侵袭和转移,hMan2c1转基因对小鼠脾脏NK细胞的活性无影响。