探索式教学模式在研究生生物医学大型仪器课程中的应用和评价

目的尝试和评价生物医学大型仪器理论与实验课程的探索式教学(IT)模式,为该教学模式的常规实施提供依据。方法在课程中开展IT小实验,总结其设计、实施、效果等;采用教育测量学理论和统计学方法对问卷进行评价,采用信度、相关性和区分度对问卷进行质量分析。结果IT小实验分别在2017级和2018级研究生选学本课程的部分学生中开展,取得了初步成果。参加人数达23人;问卷信度良好(α=0.852);27题项中有23题,与中间值比较,均有显著性差异(P<0.05)。结论问卷具有较好的区分度、信度、相关性和总体覆盖性,可用于评价教学中IT模式的需求。IT实验的合理设计、难度适中和时间安排是影响其实施效果的主要因素。

超声辅助酶切法用于溶液内蛋白质样品酶切特点分析

目的分析超声辅助酶切法对溶液内蛋白质样品酶切的特点。方法分别应用超声辅助酶切法与传统酶切法对牛血清白蛋白进行溶液内酶切,通过飞行时间质谱进行分析,对数据库检索后得到的多肽进行比较分析。结果超声辅助酶切法的酶切时间可缩短到10 min,酶切后多肽的回收率比传统酶切法低8%,但飞行时间质谱鉴定评分(MASCOT评分)比传统方法高约1倍,肽段的覆盖率高10%,匹配的多肽数多40%以上。对超声辅助酶切法鉴定出的多肽进一步分析表明,这些多肽的误切率较传统方法高22%,比传统方法多鉴定出的多肽分子质量主要在2～3 ku之间,且大部分为含有误切位点的多肽。结论超声辅助酶切可明显缩短蛋白质酶切时间,得到更好的多肽鉴定,但部分多肽酶切不完全,样品损失会更多。

室温放置4 h对样本尿蛋白质组分析的影响

目的探讨用医院检验科尿常规检查剩余的尿液样本开展尿蛋白质组分析,以便充分利用资源。方法同一个体尿液样本采集后分别采用立即冻存和室温下放置4h后冻存于-80℃备用。尿液样本分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、二维凝胶电泳和液相色谱串联质谱分析,对比两种尿液样本采集方法对尿蛋白质组分析的影响。用点杂交免疫印迹法分析了室温放置4h尿液样本(n=150)中胞质非特异性二肽酶(CNDP2)蛋白在结直肠癌(CRC)患者与健康对照尿液中的含量。结果立即冻存和经室温放置4h后冻存的尿液样本的主要蛋白条带、数量和位置无明显差异;从中分别鉴定了(1204±50,n=3)个和(1155±7,n=3)个尿蛋白质,以及(7501±661,n=3)条和(6940±182,n=3)条多肽,两组样本间无差异。尿蛋白CNDP2在结直肠癌患者尿液中含量显著高于健康对照(P<0.001)。结论采集后立即冻存和室温放置4h后冻存尿液样本的尿蛋白质组分析无明显差异。医院检验科尿常规检查剩余的尿液样本可用于尿蛋白质组分析。CNDP2在结直肠癌患者尿液中含量升高,是结直肠癌候选的尿蛋白标志物。

超声辅助胶内酶切方法的优化及其酶切特点的分析

分别应用20、100和200 W超声功率对牛血清白蛋白以及人尿蛋白组的胶内条带进行胶内酶切,通过比较不同功率鉴定的多肽数和蛋白数,确定最优的超声功率。同时比较超声辅助酶切与传统过夜酶切方法,并分析超声辅助胶内酶切方法的特点。结果表明,超声功率为20W时对胶粒破坏最小,样品损失最少,在牛血清白蛋白样品中鉴定的多肽数最多为65。在人尿蛋白组2个条带中,20 W方法鉴定的蛋白数分别为168和199,鉴定效果最优。通过对多肽误切率和不完全酶切多肽的定性和定量分析发现,超声酶切方法的误切率高于传统方法,但不完全酶切率较低。通过分析多肽误切位点发现,传统过夜酶切法和超声辅助酶切法的主要误切类型分别为脯氨酸(P)和天冬氨酸/谷氨酸(D/E),3种超声方法之间各种误切类型所占比例均无明显差别。超声辅助酶切可显著缩短蛋白质胶内酶切时间,其中20 W功率超声酶切的效果最佳。与传统过夜酶切法相比,超声辅助酶切多肽的鉴定结果更好,其多肽的误切率更高,不完全酶切率较低,可用于发现蛋白质组学研究。

免疫去除血清高丰度蛋白对组织蛋白质组鉴定的影响

目的分析去除组织中血清高丰度蛋白对组织蛋白质组鉴定的影响。方法用去除12种血清高丰度蛋白抗体柱处理人甲状腺和垂体组织样品,所得到的低丰度蛋白和原样分别进行液质联用分析,分别进行多肽和蛋白质水平的定性定量分析。结果甲状腺和垂体组织中血清高丰度蛋白分别被除去了92.11%±12.87%和78%±25%。所鉴定到的多肽和蛋白与原样品相比,甲状腺组织的非冗余性多肽提高了70%、蛋白数目提高了16.5%,垂体的非冗余性多肽提高了21.9%,鉴定蛋白数目无明显变化。结论去除组织中的血清高丰度蛋白法可以显著的提高肽段和蛋白的鉴定效率,更适用于血管密集的样品。

捕获和连接的环介导等温扩增技术

目的建立捕获和连接的环介导等温扩增(CLIP-LAMP)技术,为医学诊断和病原体检测提供新的技术手段。方法根据靶标DNA或RNA序列设计特异性的捕获探针和具有茎环结构的检测探针。无需核酸提取,直接裂解全血和干血片等样本后,通过捕获探针将靶核酸固定于96孔板上。检测探针进行特异性的连接反应,形成扩增模板,进行荧光定量的环介导等温扩增反应。将此方法应用于疟疾的检测中,定量检测疟原虫的18S rRNA,评估方法的灵敏度、特异性和重复性,并将其应用于临床样本的检测。结果此法具有较高的灵敏度和特异性,可检测到低至0.01个/μL的疟原虫,较传统的镜检和RDT灵敏度高,可准确检测到疟原虫的感染样品。此方法可在4 h内完成96个样本的检测,快速高效。结论建立了一种捕获和连接的等温扩增技术,为疾病的分子诊断和基因筛查提供了新的灵敏、高效的方法。