突触黏附分子NECL4对大脑皮质Ca^2+-CaMKII-CDC42信号通路的影响

目的探究突触黏附分子NECL4对Ca^2+-CaMKII-CDC42信号通路和树突棘数量的影响。方法以Necl4全身性敲除小鼠为研究对象,对8周龄的Necl4野生(WT)及敲除(KO)小鼠脑组织进行高尔基染色,对大脑皮质第Ⅱ/Ⅲ层椎体神经元二级树突上树突棘密度进行统计。通过Western blot和RT-qPCR实验对Ca^2+-CaMKII信号通路及其下游信号分子的蛋白和mRNA表达水平进行检测,包括CDC42、Rac1、RhoA、H-Ras、ERK等信号蛋白。结果高尔基染色结果显示,Necl4敲除小鼠大脑皮质第Ⅱ/Ⅲ层椎体神经元二级树突上树突棘数量与野生型小鼠相比减少(P<0.01)。Western blot实验结果显示CaMKIIα(P<0.05)及phospho-CaMKIIα(Thr286)(P<0.05)在Necl4敲除小鼠中表达降低,CaMKIIα的下游信号分子CDC42的mRNA水平(P<0.05)和蛋白水平(P<0.05)在Necl4敲除小鼠中均表达降低。结论NECL4通过Ca^2+-CaMKII-CDC42信号通路对小鼠大脑皮质树突棘数量进行调控。

人肝癌细胞系HepG2和Huh7中的基因组拷贝数变异分析

目的利用人肝细胞癌拷贝数变异和转录组实验,结合临床公共数据,探索肝细胞癌的拷贝数变异对肝癌发生发展的影响。方法用光学基因组图谱技术识别肝癌细胞系HepG2和Huh7中的拷贝数变异,随后分析两种细胞系拷贝数变异基因的功能,并根据富集通路绘制蛋白质相互作用网络。选取两个细胞系核心网络中的关键基因,分析肝细胞癌拷贝数变异与基因表达之间的关系。GEPIA数据库分析基因表达与患者临床生存的关系。用RNA-seq实验和公共数据验证基因的表达水平。结果HepG2细胞主要存在拷贝数增加,相关基因富集在雌激素信号通路、金黄色葡萄球菌感染等通路;Huh7细胞系中既有拷贝数增加又有减少,相关基因主要富集嗅觉传导、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。关键基因SRC、MAPK3和MAP3K7拷贝数与基因表达成正比,并且高表达这些基因的患者生存期显著降低(P<0.05)。相比于HEK293T细胞系,SRC、MAP3K7基因在两个肝癌细胞系的表达显著升高(P<0.001),提示了肝细胞癌的特异性变异,MAPK3无差异。结论肝细胞癌拷贝数变异基因SRC、MAP3K7的表达与患者的预后显著相关,可能影响肝细胞癌的发生发展和异质性。

nPTB基因座上T-uc.33在小鼠神经系统发育中的功能

目的 n PTB基因座上T-uc.33这一超保守长非编码RNA的鉴定及其在小鼠神经系统发育过程中的功能。方法利用生物信息学方法和实验对现存的481个超保守区域(UCRs)进行数据挖掘和检测,筛选到n PTB基因座上存在的UCR,即T-uc.33,并用RACE扩增T-uc.33的RNA转录本全长;用实时荧光定量PCR检测T-uc.33和n PTB在小鼠脑组织发育及神经干细胞分化不同时间点的表达谱;用siRNAs转染细胞法检测T-uc.33对n PTB所起的调控作用。结果筛选并鉴定了n PTB基因座上的T-uc.33为真实转录的超保守长非编码RNA,全长为807 nt;T-uc.33和n PTB在小鼠脑组织中的表达呈显著正相关(P<0.01),并随着脑组织发育从胚胎到成年期呈现先升高后降低的趋势,在体外神经干细胞分化过程也存在差异表达;敲低T-uc.33可显著降低n PTB的表达(P<0.01)。结论 T-uc.33为n PTB基因座上的超保守长非编码RNA,对n PTB起到正向调控作用,潜在地影响小鼠脑组织发育和神经干细胞的分化过程。

染色质体外组装相关蛋白的表达纯化及组装体系的建立

目的提取并纯化真核细胞核内组蛋白,表达并纯化重组组蛋白、染色质组装相关因子NAP-1(nuclear assemblyprotein-1)及ACF(ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor),并建立无细胞体外染色质组装体系。方法在大肠杆菌BL21中表达并应用离子交换层析纯化组蛋白,从真核细胞HeLa细胞核中提取并应用羟基磷灰石纯化组蛋白八聚体,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf9中表达并纯化组装相关因子,应用纯化得到的蛋白在适宜条件下进行染色质体外组装,并用微球菌核酸酶酶切检测。结果获得了高纯度的原核表达的组蛋白,真核细胞组蛋白八聚体及组蛋白特异伴侣NAP-1和ACF;建立了由质粒DNA、纯化的真核细胞核内重组组蛋白、重组NAP-1、重组ACF及ATP为核心成分的体外染色质组装的无细胞系统,经微球菌核酸酶检测组装成功。结论利用体外分离纯化的多种重组蛋白,可成功构建基因的染色质模板,为在体外染色质模板上进行基因转录的调控机制研究奠定了基础。

RNA结合蛋白KSRP在急性髓系白血病(AML)M5型细胞中的功能

目的探讨RNA结合蛋白KSRP在不同类型急性髓系白血病(AML)中的表达,并研究KSRP对AML细胞增殖的调控功能。方法利用基因表达汇编(GEO)数据集和癌基因组图谱(TCGA)的数据分析KSRP在AML中的表达水平;在人外周血的单核细胞系(THP-1)中利用慢病毒传导分别抑制KSRP的内源表达或者过表达miR-129,检测细胞的增殖和凋亡。结果 KSRP在t(15;17)型急性早幼粒细胞白血病中低表达,而在混合谱系白血病(MLL)易位的急性单核细胞白血病或急性粒-单核细胞白血病中高表达。抑制内源KSRP的表达后显著抑制了THP-1细胞的增殖(P<0.01)而促进细胞凋亡(P<0.01)。过表达miR-129后促进THP-1细胞的增殖(P<0.05)。结论KSRP通过促进miR-129的加工调控AML-M5型细胞的增殖。

近红外双荧光系统在磷酸酯酶筛选中的应用

目的应用奥德赛(Odyssey)近红外双荧光系统筛选去甲基化酶KDM3A去磷酸化的磷酸酯酶。方法使用磷酸酯酶干扰质粒转染HEK293T细胞,使用磷酸化的KDM3A抗体对细胞进行杂交,近红外荧光染料DRAQ5标记细胞核,利用奥德赛(Odyssey)近红外双荧光系统对细胞进行荧光扫描,荧光强度的比值可代表细胞内相对KDM3A磷酸化水平,进而筛选出相关的磷酸酯酶。结果磷酸酯酶广谱抑制剂冈崎酸OA处理转染后的细胞,近红外双荧光扫描系统可以检测到KDM3A的磷酸化,初步筛选出4个可能参与KDM3A去磷酸化的磷酸酯酶亚基。结论近红外双荧光系统可以应用于磷酸酯酶的初步筛选。

烯醇化酶1通过影响mRNA定位调节人胚胎干细胞自我更新能力

目的探究烯醇化酶1(ENO1)的表达对维持人胚胎干细胞(hESCs)自我更新能力的影响,并揭示其机制。方法预测与ENO1结合的RNA和蛋白质,并进行GO富集分析。在hESCs中通过shRNA抑制ENO1内源表达,集落形成实验及碱性磷酸酶染色(AP)检测hESCs的集落形成能力,荧光定量PCR检测hESCs的多能性及分化标志基因的表达变化,RNA荧光原位杂交技术检测带有polyA尾的RNA的定位变化。结果抑制ENO1的内源表达后,hESCs的集落形成能力得到了显著抑制(P<0.05),同时分化标志基因表达水平升高(P<0.001),带polyA尾的RNA的定位由分散在细胞质中变为集中在核内(P<0.001)。结论ENO1通过影响mRNA在细胞内的定位调控hESCs自我更新能力。

基因Cdca2敲除对小鼠精子发生和生育力无明显影响

目的探究睾丸高表达细胞分裂周期相关蛋白2基因(Cdca2)在小鼠精子发生和生育力中的生理功能。方法通过Q-PCR和Western blot检测Cdca2在小鼠不同组织部位的表达情况;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和Cre-loxP介导的重组系统构建Cdca2组织特异性敲除的小鼠品系;通过苏木精-伊红(HE)染色和形态学分析了解小鼠CDCA2缺失对精子发生的各个阶段生精细胞形态的影响;通过精子全自动检测分析系统检测小鼠CDCA2缺失对精子活率及运动参数的影响;通过生育力测试实验检测CDCA2缺失对雄性小鼠生育能力的影响。结果Cdca2是一个睾丸高表达的基因;利用CRISPR/Cas9技术和生殖系统特异性Cre的工具鼠,成功获得了Cdca2生殖细胞特异性敲除的小鼠;小鼠CDCA2缺失对精子发生中各阶段生精细胞、精子运动参数及雄性生育能力的影响改变无统计学意义。结论基因Cdca2对于小鼠精子发生和雄性生育力的维持可能是非必需的。

小RNA干扰PCBP2在神经胶质瘤细胞中对P53相关基因的调节和对细胞增殖的影响

目的探索多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)表达下调对相关基因和胶质瘤细胞增殖的影响。方法 3株神经胶质瘤细胞系(T98G、U87MG和U251)各分为2组,分别转入特异性靶向PCBP2基因的小干扰RNA(siRNA)和对照siRNA,用Western blot法检测siRNA对PCBP2蛋白的抑制效果及对P53蛋白和它的两个靶基因PUMA和BAX的表达影响,同时检测P53共调节因子FHL2和同家族成员FHL1表达变化。用生物素pull-down分析PCBP2是否和FHL家族成员mRNA结合。用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)掺入法检测细胞增殖能力,Hoechst染色观察细胞凋亡率。结果 PCBP2 siRNA转染这3株细胞后使PCBP2蛋白表达水平明显下调(P<0.05);增加P53及它的靶基因PUMA和BAX的蛋白表达(P<0.05);抑制FHL2蛋白(P<0.05),但并不结合其mRNA的3'非编码区(3'UTR);Brd U阳性细胞减少(P<0.05);Hoechst染色阳性细胞增多(P<0.05)。结论抑制PCBP2表达可以增强胶质瘤细胞中P53通路活性,并减弱细胞增殖能力,诱导细胞凋亡。

IFN-λR1与TRAF6的相互作用及对NF-κB与ISRE活性的影响

目的构建含有信号肽的全长IFN-λR1质粒,研究在配体IFN-λ1存在的情况下IFN-λR1与TRAF6的相互作用及对NF-κB与ISRE活性的影响。方法利用多次PCR将信号肽编码序列引入IFN-λR1序列中,构建表达载体,用免疫荧光及膜蛋白分离实验鉴定IFN-λR1的表达定位。用免疫共沉淀的方法研究IFN-λ1刺激下IFN-λR1与TRAF6间的相互作用。用双荧光素酶报告基因实验研究IFN-λR1与TRAF6相互作用后对下游NF-κB与ISRE活性的影响,采用实时定量PCR的方法检测此种作用对OAS1与Mx1基因表达的影响。结果成功构建了含信号肽的全长IFN-λR1表达载体,细胞内表达的IFN-λR1可正确定位于细胞膜上。细胞共转染IFN-λR1和TRAF6,在免疫沉淀物中可以检测到两个蛋白同时存在。细胞内共表达的IFN-λR1能够抑制TRAF6诱导的NF-λB的激活,而共表达的TRAF6可以抑制IFN-λR1下游ISRE的活性,并下调OAS1与Mx1基因的表达。结论证实了在IFN-λ1存在下IFN-λR1与TRAF6的相互作用及二者相互作用对各自细胞信号转导通路的影响,为TRAF6作为IFN-λ受体信号通路中的相互作用蛋白提供了新的实验依据。

主动免疫肌动蛋白样蛋白7a蛋白引起小鼠睾丸曲细精管的损伤

目的原核表达并纯化全长的人精子肌动蛋白样蛋白7a(ACTL7a)蛋白,检测主动免疫ACTL7a产生抗精子抗体后小鼠睾丸的损伤情况。方法构建重组表达质粒pET30a-ACTL7a,以重组质粒转化E.coli Rosseta(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过镍离子金属螯合树脂纯化和SDS-PAGE切胶分离目的蛋白,溶胶后以表达的ACTL7a蛋白免疫ICR小鼠。ELISA检测抗体效价,PAS染色检测主动免疫后曲细精管的发育。结果经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达出目的蛋白ACTL7a,纯化后免疫ICR小鼠,经PAS染色发现主动免疫ACTL7a的小鼠其睾丸曲细精管出现生精细胞脱落、核凝聚、生精细胞缺如、生精细胞退化等异常的管腔。结论成功构建了ACTL7a基因全长的原核表达载体,经诱导表达和纯化获得高纯度的目的蛋白。发现ACTL7a蛋白主动免疫ICR小鼠产生抗精子抗体后,小鼠睾丸的曲细精管发生严重损伤。

利用RIP-Chip筛选结合多聚胞嘧啶结合蛋白2的microRNAs

目的通过核糖核蛋白免疫沉淀-芯片技术(RIP-Chip)在人正常神经胶质细胞(HA)和神经胶质瘤细胞(T98G和U87MG)中筛选与多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)相互作用的microRNA(miRNA)。方法选择兔抗人PCBP2抗体,用Western blot法检测PCBP2蛋白在HA、T98G和U87MG细胞中的表达。用兔Ig G作为阴性对照,收集3种细胞的RIP蛋白和RNA样品,通过Western blot检测PCBP2蛋白富集效果,利用Nano Drop定量并经Agilent2100检测RNA完整性。选择Affymetrix miRNA 3.0芯片对RNA样品进行杂交,筛选富集4倍以上且P<0.05的miRNA。结果用PCBP2抗体进行RIP-Chip实验,最终筛选和PCBP2相互作用的103条miRNA,1条前体miRNA和1条核仁小分子RNA;其中15条存在PCBP2的结合位点。结论 PCBP2可以通过识别靶序列或者以核糖核蛋白复合物形式在细胞内结合成熟的miRNA、前体miRNA或核仁小分子RNA。

C57BL/6J小鼠慢性束缚应激抑郁症模型的建立

目的通过慢性束缚应激（CRS）建立C57BL/6J小鼠抑郁症模型。方法 C57BL/6J小鼠经体重、糖水偏好、旷场实验初筛后从中选择20只小鼠并随机分为正常对照（NC）组和CRS组2组,每组10只。对CRS组小鼠进行连续21 d,每天4 h的束缚刺激,并最终进行糖水偏好检测和强迫游泳检测。结果 CRS组小鼠在水中不动的时间为（131.70±21.65）s,明显长于NC组的（68.88±8.43）s（P=0.0304）。CRS组小鼠0～24 h和0～48 h的糖水偏好百分比分别为（66.21±3.24）%和（73.25±1.50）%,均明显低于NC组的（79.46±3.85）%（P=0.0196）和（80.20±2.26）%（P=0.0248）。结论通过慢性束缚应激成功建立C57BL/6J小鼠抑郁症模型。

生长相关蛋白-43在内侧颞叶癫痫小鼠模型海马中的表达

目的研究癫痫发生不同时期生长相关蛋白-43(GAP-43)及其磷酸化形式(p-GAP-43)在海马齿状回中表达的时空分布情况。方法构建海人酸(KA)诱导的内侧颞叶癫痫(MTLE)模型小鼠,采用免疫组织化学、Western blot技术检测GAP-43与p-GAP-43在模型鼠癫痫发生不同时期(5d,2、5周)海马齿状回中的表达变化。结果 GAP-43在正常对照鼠及模型鼠的齿状回、门区和海马内分子层均有较高表达。与对照组相比,p-GAP-43在KA诱导癫痫发作后的5d,2、5周3个时间点的表达水平逐步下降。结论活性形式磷酸化的GAP-43在齿状回颗粒细胞中的表达水平随着癫痫发作时间的推移逐步降低,可能与硬化海马的轴树突异常重组过程相关。

Dlx1的天然反义转录物在大脑发育中的功能探索

目的探索Dlx1的天然反义转录物(Dlx1as)在小鼠大脑发育过程中的功能。方法根据生物信息学分析与分子生物学实验验证Dlx1as是否具有多聚腺苷酸尾,采用实时定量PCR检测Dlx1as与Dlx1 mRNA在小鼠大脑发育过程中随时间的变化,利用原位杂交的技术比较Dlx1as与Dlx1 mRNA空间表达谱。结果 Dlx1as具有多聚腺苷酸尾,在小鼠的胚胎发育过程中,从E14.5到E18.5高表达,与Dlx1 mRNA在各时间点表达水平虽比较接近,但在表达区域存在互补的特点。结论 Dlx1as在小鼠大脑发育过程中有一段时间的高表达,与蛋白编码基因Dlx1 mRNA空间互补,推测其可能是通过调控Dlx1 mRNA来影响小鼠的大脑发育。

小RNA干扰蛋白酶体亚基α7抑制K562细胞增殖

目的运用小干扰RNA(siRNA)技术降低人髓性白血病细胞株K562细胞20S蛋白酶体亚基α7(PSMA7)基因的表达水平,探讨PSMA7表达下调对其细胞功能的影响。方法采用HiPerFect将化学合成的针对人PSMA7基因的特异性siRNA转染入K562细胞后,用Western blot法检测siRNA对PSMA7蛋白表达的抑制效果,采用MTS法及细胞计数法检测细胞增殖速率,流式细胞术检测细胞周期分布,Western blot法检测细胞周期蛋白Cyclin A、D、E的表达水平,Annexin V/FITC染色后流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 PSMA7 siRNA转染K562细胞后使PSMA7蛋白表达水平明显下调;细胞增殖速率明显降低但无明显细胞凋亡,细胞周期中S期细胞比例减少;细胞周期蛋白Cyclin A、E表达下调。结论 PSMA7表达下调可使人髓性白血病细胞株K562细胞Cyclin A、E表达下调,使S期细胞比例降低从而抑制K562细胞增殖。

TXNDC5介导缺血清诱导的HeLa细胞增殖抑制

目的研究TXNDC5在缺血清诱导的HeLa细胞增殖抑制过程中的作用。方法在人HeLa细胞中分别过表达TXDNC5或用干扰小RNA(siRNA)抑制TXDNC5的表达后,对其进行正常或缺血清培养,采用Western blot法检测TXDNC5蛋白水平,荧光实时定量PCR检测TXDNC5 mRNA水平,细胞增殖检测试剂盒(MTS法)检测活细胞数,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果缺血清诱导HeLa细胞增殖抑制时,TXNDC5 mRNA水平下降(P<0.05),蛋白水平显著升高,TXNDC5 mRNA的稳定性不受影响,而放线菌酮则可消除缺血清诱导TXNDC5蛋白水平升高的作用。在HeLa细胞中过表达TXNDC5对细胞增殖速度无影响。抑制TXNDC5的表达能减弱缺血清诱导的HeLa细胞增殖抑制(P<0.05),使S期细胞比例略有增加(P<0.05),但对细胞凋亡没有明显影响。结论 TXNDC5介导了缺血清诱导的HeLa细胞增殖抑制。

CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白与钙联蛋白在内侧颞叶癫痫模型小鼠海马中的表达

目的观察CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及钙联蛋白(CNX)在内侧颞叶癫痫小鼠海马区域中表达的时间和空间分布。方法采用海人酸(KA)诱导内侧颞叶癫痫小鼠模型,免疫印迹和免疫荧光技术检测CHOP和CNX在急性期(12、24 h)小鼠海马CA3区的表达量及分布差异,并与注射PBS的正常小鼠进行对照。结果免疫印迹检测结果显示,KA注射后12 h小鼠海马中的CHOP(F=1.136,P=0.4069)和CNX表达量(F=2.378,P=0.2087)与对照组差异没有统计学意义,KA注射后24 h注射侧海马中的CHOP(F=8.510,P=0.0362)和CNX表达量(F=6.968,P=0.0497)明显高于对照组。免疫荧光结果显示,KA注射后12 h CHOP的表达主要集中于CA3区,注射后24 h在CA1和CA3区表达水平均升高;KA注射后24 h CHOP蛋白(F=24.480,P=0.0057)和CNX蛋白(F=7.149,P=0.0478)的表达量显著高于对照组。结论伴随着癫痫发作的产生,CHOP蛋白表达量上升,提示神经元内质网应激水平不断增加,可能需要更多CNX作为分子伴侣帮助更多未折叠蛋白完成折叠过程。

RYBP慢病毒表达载体的构建及对结肠癌细胞HCT116增殖的影响

目的构建RYBP慢病毒表达载体pWPI-RYBP,包装慢病毒颗粒并感染结肠癌细胞HCT116,分析RYBP的表达及对HCT116细胞增殖的影响。方法用DNA克隆技术在慢病毒表达载体pWPI-IRES-EGFP序列中引入Flag标签及多个单酶切位点序列,改造后的载体命名为pWPI-linker。采用反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)从肝癌SK-Hep-1细胞总RNA中扩增RYBP的全长开放阅读框序列,克隆入pWPI-linker载体中,得到pWPI-RYBP。利用人胚肾细胞HEK293T包装重组慢病毒颗粒,分析该慢病毒颗粒感染HCT116细胞的效率、RYBP蛋白的表达,用MTS方法分析RYBP过表达对HCT116细胞增殖的影响。结果用改造的pWPI-linker载体成功构建慢病毒表达载体pWPI-RYBP包装的慢病毒颗粒能高效感染HCT116细胞,表达出Flag-RYBP融合蛋白。MTS方法分析表明,RYBP的过表达抑制HCT116细胞的增殖,增殖抑制率达26.1%。结论改建的慢病毒表达载体pWPI-linker带有可供选择的多个单克隆位点和标签蛋白序列,为今后基于pWPI载体的克隆构建和表达蛋白质的分析提供了极大的便利;RYBP慢病毒表达载体pWPI-RYBP的构建为进一步研究RYBP的生物学功能及基因治疗奠定了基础。

米诺环素增加情绪有关脑区ΔFosB的表达来减轻LPS诱导的小鼠神经炎性反应

目的探究转录因子ΔFosB在米诺环素减轻脂多糖(LPS)诱导的神经炎性反应中的作用。方法成年C57BL/6小鼠连续3 d经腹膜内注射0.9%氯化钠溶液或米诺环素(50mg/kg),第3天再分别注射0.9%氯化钠溶液或LPS(0.83 mg/kg),注射后6或24 h取样。用免疫组化实验观察特定脑区小胶质细胞形态和ΔFosB的表达,以分析米诺环素对LPS导致神经炎性反应的抑制作用和ΔFosB的表达分布。用Image-Pro Premier 3D分析图像,用GraphPad Prism进行统计学分析。结果米诺环素可以有效减少蓝斑(LC)中LPS导致的小胶质细胞胞体面积的增加(P<0.05),减少中枢的炎性反应。同时,米诺环素增加了抑郁症相关脑区LC(P<0.001),臂旁核(LPB,P<0.05)和下丘脑室旁核(PVN,P<0.05)中ΔFosB的表达。结论米诺环素可能通过增加情绪有关脑区LC,LPB,PVN中ΔFosB的表达来减轻脂多糖诱导的神经炎性反应。