慢性肾病并发慢性心血管损伤大鼠模型的建立

目的:通过在饲料中添加腺嘌呤建立肾脏损伤大鼠模型,研究肾病和心血管损伤发生时人体组织的变化。方法:雄性Wistar大鼠饲喂不同质量分数的腺嘌呤(最长16周)进行剂量范围实验后,选用质量分数为0.25%的腺嘌呤作为后续试验的标准剂量,测量大鼠肾功能(血浆尿素氮、血清肌酐及其清除率、血清尿酸、蛋白尿)、肾脏结构(胶原、炎症、肾小球肥大)、纤维化(TGF-β、α-SMA)、炎症(TNF-α、NF-κB p52、NF-κB p50、PLA2、ED1)、心血管参数(血压、左心室顺应性、血管反应)等指标。用25 mg/(kg·天)的别嘌呤醇(仅在最后8周给药)评估尿酸在大鼠肾病模型导致的病理改变中的作用。结果:0.25%腺嘌呤饲喂可在第16周诱导出现显著的人类慢性肾脏疾病样病理改变,具体表现为血浆尿素氮升高(0.25%腺嘌呤56.5±5.4 mmol/L,对照6.2±0.6 mmol/L,P<0.05)、血清肌酐升高(0.25%腺嘌呤268±23μg/L,对照41.9±2.8μg/L,P<0.05),蛋白尿、慢性炎症巨噬细胞和肌成纤维细胞浸润、胶原沉积增多,小管萎缩、凋亡,TNF-α和TGF-β表达升高,血清尿酸升高。心血管改变包括心室纤维化加重、收缩压和左心室硬度升高、血管反应受损。别嘌呤醇能够降低血清尿酸浓度并逆转腺嘌呤诱导的肾脏和心血管损伤。结论:0.25%腺嘌呤饲喂大鼠能够诱导慢性肾脏和心血管损伤。尿酸升高可能是诱导此损伤的原因,因为应用别嘌呤醇降低尿酸后,肾脏和心血管损伤程度减轻。

人LDHA原核表达载体的构建、蛋白纯化及活性鉴定

目的构建带GST标签的人乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)基因原核表达载体并纯化GST-LDHA融合蛋白,为进一步研究该基因在肿瘤中的作用作准备。方法以人乳腺文库为模板,通过PCR扩增LDHA基因片段;利用EcoRⅠ及HindⅢ酶切带GST标签的载体及LDHA基因PCR产物,并连接形成GST-LDHA重组质粒进行测序; GST-LDHA重组质粒转化入Rossate感受态,并加入合适比例的IPTG进行小量诱导,通过Western印迹检测GST-LDHA蛋白表达;诱导成功的GST-LDHA重组质粒转化入Rossate感受态细胞进行大量增菌,IPTG诱导蛋白表达,利用GST琼脂糖凝胶4B亲和珠纯化GST-LDHA蛋白,并用考马斯亮蓝染色检测,获得纯度较好的蛋白。结果获得大小约1000 bp的LDHA基因; GST-LDHA重组质粒构建成功;诱导GST-LDHA融合蛋白的表达并纯化获得纯度较好的融合蛋白。结论成功获得带GST标签的人LDHA基因的原核表达产物,为进一步研究LDHA在肿瘤中的作用奠定了基础。