超抗原SEB诱导大鼠高危角膜移植免疫耐受淋巴细胞差异表达基因的研究

目的应用基因芯片研究高危角膜移植中产生免疫耐受和发生排斥反应的受体大鼠淋巴细胞的差异基因。方法供体和受体分别为Fisher344和Lewis大鼠。受体大鼠随机分为2组,治疗组术前腹腔注射0·2ml SEB(75μg/kg),每次间隔4d,共3次。对照组注射生理盐水。缝线法建立高危角膜移植动物模型。术后研究受体植片存活时间、免疫状态和淋巴细胞差异基因。结果对照组植片平均存活时间为(7·30±0·67)d,治疗组为(12·50±1·41)d,(P<0·05)。治疗组淋巴细胞对ConA和供体淋巴细胞抗原的增生反应明显降低,DTH反应强度也明显降低。基因芯片显示两组淋巴细胞存在23个差异基因,与神经系统、肿瘤生长以及编码酶类有关。结论SEB可诱导高危角膜移植免疫耐受,相关淋巴细胞差异基因的作用需进一步研究。

供体骨髓细胞输注诱导免疫耐受延长猪-猴异种角膜移植植片存活的研究

目的观察受体猴在环磷酰胺(CTX)预处理下输注供体猪骨髓(BM)细胞后对猪-猴角膜移植植片的存活时间的影响,并探讨相关免疫调节机制。方法供体为五指山小型猪(WZS),受体为恒河猴。将18只受体猴采用数字表法随机分为3组,组1为CTX预处理后行1次骨髓细胞输注,组2为CTX预处理后行2次骨髓细胞输注,组3为CTX预处理后不行骨髓细胞输注。之后行穿透性角膜移植术,术后观察植片的存活情况并分别应用混合淋巴细胞反应测定、免疫浊度法和流式细胞仪检测受体猴全身免疫状态。术后1个月取角膜植片行组织病理学检查。结果组1的角膜植片平均存活时间为(36.0±4.7)d,组2为(32.8±6.4)d,组3为(17.7±3.2)d。与组3相比,组1和组2均能明显延长植片存活时间(P<0.01)。混合淋巴细胞反应测定显示组1和组2受体猴对供体脾脏淋巴细胞的反应性降低,而组3的反应性无明显变化。3组术后第1～2周内IgG、IgA、IgM、补体C3、C4浓度升高,组1和组2术后外周血中CD4+T细胞呈下降趋势,CD8+T细胞呈先上升后下降趋势,CD16+T细胞术后1周达最高值;而组3中CD4+T细胞术后升高,CD8+T细胞先下降后上升,CD16+T细胞术后2周达最高值。术后1个月组织病理学检查可见组1和组2植片中少量淋巴细胞浸润,前房无渗出膜,无噬酸性粒细胞浸润;而组3植片中大量淋巴细胞浸润,角膜内皮层破坏,内皮面形成渗出膜,有噬酸性粒细胞浸润。结论CTX预处理下输注供体骨髓细胞能够明显延长异种角膜植片的存活时间,降低受体淋巴细胞对供体特异免疫反应性,免疫排斥反应的发生与体液免疫和细胞免疫有关。

规范我国眼库建设

根据国内外眼库现状,分析我国眼库建设存在的问题,指出合理、适度规划眼库建设,构建眼库网络体系、保障眼库供应能力的重要性;同时应关注角膜中期保存,生物材料安全性,角膜捐献的广泛宣传等问题;强调需加强眼库材料保存的基础研究。

碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对角膜中期保存液保存人角膜内皮细胞的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对中期保存角膜内皮细胞活性的影响。方法角膜中期保存液保存人角膜环,对照组为角膜中期保存液,实验组分为A、B、C、D组,分别为角膜中期保存液中加入bFGF(5ng/ml)、bFGF(20ng/ml)、EGF及bFGF+EGF,在保存角膜第3、7、14天后分别取保存角膜环复温观察,锥虫蓝茜素红联合染色检测角膜内皮活细胞率,电镜检测细胞超微结构的改变。结果保存角膜环第14天角膜内皮活细胞率,对照组为(10.35±1.32)%,A组为(62.18±1.56)%,B组为(92.57±0.90)%,C组为(71.01±2.67)%,D组(82.59±1.45)%,与对照组比较,各保存时间各实验组活细胞率均高,差异有统计学意义(P<0.01)。保存第14天,对照组保存的角膜环明显水肿、混浊不透明、内皮细胞形态结构不完整,超微结构显示角膜内皮细胞Y型连接断裂;而实验B、D组,保存的角膜环轻度水肿、后弹力层皱褶少、角膜透明度高、内皮细胞形态结构完整,超微结构显示保存角膜内皮细胞连接紧密,Y型连接无明显断裂,细胞表面可见较丰富的微绒毛,胞体大,核突起明显。结论bFGF和EGF在角膜中期保存液中均有促进细胞增殖、保持角膜细胞活性的作用,以bFGF作用更明显。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B亚单位防治大鼠高危角膜移植免疫排斥反应的研究

目的探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B亚单位(SEB)对大鼠高危角膜移植免疫排斥反应的防治作用机制。方法实验供体为30只Fisher344和4只Lewis大鼠,受体为64只Lewis大鼠。将实验受体大鼠按随机数字表法随机分为4个治疗组和1个对照组,每组12只;同时设4只Lewis大鼠行同种同体移植。治疗组术前分别用02ml不同浓度的SEB(25、50、75、100μg/kg)腹腔注射诱导免疫耐受。对照组用02ml生理盐水腹腔注射。缝线法诱导受体角膜新生血管,然后行穿透性角膜移植术,术后观察记录植片的存活状况并对受体全身免疫状态进行免疫组化染色,流式细胞分析和淋巴细胞增殖能力检测。结果对照组大鼠角膜植片的平均存活时间为(730±067)d,SEB治疗组(25、50、75、100μg/kg)植片存活时间分别为(643±127)d、(1070±250)d、(1250±141)d、(883±194)d。免疫组织化学染色和流式细胞检测显示SEB治疗组大鼠角膜植片中淋巴细胞的浸润以及外周免疫器官中淋巴细胞亚群百分数较对照组明显降低。此外,SEB治疗组中受体淋巴细胞对供体抗原刺激的反应性降低,外周血中白细胞介素(IL)2浓度降低而IL10浓度升高,其中以SEB75μg/kg组作用最明显。结论在一定剂量范围内,SEB可以诱导大鼠免疫耐受形成,减少局部和全身淋巴细胞数量。

猪-猴异种角膜移植的初步研究

目的探讨猪-猴穿透性角膜移植术后排斥反应的特点及糖皮质激素在异种角膜移植排斥反应中的作用。方法3月龄五指山小型猪（WZS）6只为供体，恒河猴12只为受体，建立猪-猴异种穿透性角膜移植动物模型。受体猴分为角膜移植组和激素干预组，每组6只。激素干预组角膜移植术毕，结膜下注射复方倍他米松注射液0．5ml（7mg／m1），术后每10d结膜下注射长效倍他米松注射液0．3ml，共10次；角膜移植组术后相同时间点注射等量生理盐水。观察两组术后植片的存活情况，术后1个月取角膜植片行病理组织学检查，流式蛋白分析系统检测猴血浆与房水中细胞因子IFN、TNF、IL-4、IL-5及IL-10浓度。免疫浊度法检测猴外周血免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C3、C4的变化。流式细胞仪分析手术前后受体全血中CIM^＋、CD8^＋、CD16^＋T淋巴细胞的比率变化。结果猪-猴穿透性角膜移植组植片平均存活时间为（15．54-2．3）d；激素干预组为（182．84-66．1）d。角膜移植组植片术后在前房形成渗出膜，角膜植片水肿明显，植片新生血管长入。而激素干预组在给药期间植片维持透明，仅有轻微的植片水肿反应。组织病理学显示角膜移植组植片较植床明显增厚，上皮下及前基质层炎性细胞浸润，后基质和角膜内皮层破坏，内皮面形成渗出膜；激素干预组植片少量淋巴细胞浸润，内皮完整，无渗出膜。在术后第3周角膜移植组受体猴房水中各种细胞因子浓度均升高，尤其以IFN升高明显；而激素干预组中房水的细胞因子变化主要是IL-10和IL-4浓度升高，但IFN和TNF的浓度均有降低。两组猴全身体液免疫和细胞免疫指标显示，角膜移植组术后第2～3周免疫球蛋白IgG、IgA、IgM及补体C3、C4浓度升高，而激素干预组IgG和补体C4浓度降低。结论猪．猴异种角膜移植术后的主要表现为角膜内皮排斥反应，全身体液免疫可能参与排斥反应的发生，局部应用糖皮质激素能明显延长植片存活时问。（中华腰科杂志，2007，43：594-601）

角膜缘干细胞研究及相关问题

角膜缘干细胞的基础与临床研究促进了眼表疾病的发展。本文分析了角膜缘干细胞的解剖特点、增生能力、表面标志蛋白在鉴定干细胞中的作用和存在的问题,提出临床诊断角膜缘干细胞缺乏症的手段,并归纳了各种角膜缘上皮移植术后的治疗效果与细胞转归,为进一步研究角膜缘干细胞提出了需要解决的关键问题。

不同种族角膜植片对穿透性角膜移植术效果的影响

目的通过观察不同种族问穿透性角膜移植手术的效果，总结不同种族之间穿透性角膜移植的可行性。设计回顾性病例系列。研究对象北京同仁眼科中心2002年10月至2003年3月因角膜白斑、角膜内皮失代偿、角膜移植术后植片失败等接受穿透性角膜移植术患者10例（10眼）。方法采用国际组织库提供的中期保存角膜植片进行穿透性角膜移植术，其中高加索人种角膜8片，西班牙人种1片，非洲人种1片。术前收集患者资料，术后进行随访和临床观察，评价角膜植片的存活情况以及疗效。主要指标视力，角膜植片透明度，角膜新生血管分级。结果10例患者平均随访（12．6±3．86）个月，4例患者角膜植片基本保持透明，视力平均提高1-2行。6例（60％）患者出现植片混浊、植片水肿、新生血管长人等排斥反应，视力不提高。结论本文小样本观察显示不同种族角膜供体可以用于穿透性角膜移植治疗。

单纯疱疹病毒性角膜炎角膜组织病毒潜伏感染的PCR检测分析

目的探讨通过穿透性角膜移植获取的单纯疱疹病毒性角膜炎病变角膜组织中1型单纯疱疹病毒(HSV-1)DNA的表达情况及意义。设计实验研究。研究对象2010年5-12月北京同仁医院因病毒性角膜炎角膜白斑行穿透性角膜移植术后角膜标本20例,圆锥角膜、大泡性角膜病变和角膜营养不良等非感染性角膜病变的角膜标本20例。方法对角膜组织标本中HSV-1 DNA进行聚合酶链反应(PCR)检测。主要指标HSV-1 DNA的阳性率。结果单纯疱疹病毒性角膜炎静止期患者角膜组织中12/20例(60%)检出HSV-1 DNA,非感染性角膜组织中6/20例(30%)检出HSV-1 DNA(χ2=3.64,P=0.057)。结论单纯疱疹病毒性角膜炎静止期角膜组织多数表达HSV-1 DNA,角膜内潜伏病毒是引起单纯疱疹病毒性角膜炎的可能原因,正常人角膜也可能有HSV-1的DNA存在。

应用封闭式K液保存角膜的研究

随着眼库技术的发展,应用组织培养基质保存角膜已被各国眼库所采用。因此,应用K 液保存角膜为一种良好的中期供体角膜的保存法,自Kaufman (1983)发明以来,经过许多学者的研究,其保存效果更为可靠,并具备简单、经济及实用等优点。现将我院眼库应用封闭式K 液保存角膜的研究报告如下。材料及方法一、一般资料我们采用封闭式K 液保存角膜,其主要成分为Tc—199及2.5%硫酸软骨素(分子量50000)。K 液本身不含动物血清,我们在其中一部分(占1/3)加入了2%小牛血清进行比较。除此以外,还在K 液中加入90μg/ml 庆大霉素,pH 保持在7.2～7.4之间,渗透压维持在305～308moSmol。

供体角膜细菌污染的调查

角膜材料是角膜移植术成功的重要条件之一。正常眼结膜和角膜通常均有细菌生长。尽管限库对供体角膜采取了多种除菌措施，仍有相当数量供体角膜细菌培养为阳性，其中以葡萄球菌和链球菌等革兰氏阳性菌居多。虽然角膜移植术后眼内炎发生率较低(<1％)，但仍有必要对供体角膜进行细菌堵养，为角膜移植患者术后处理提供客观依据。现将我们从1991年12月至1993年8月对157例供体角膜的细菌培养报道如下。

正常人角膜内皮细胞影象分析

使用日本 Konan SP5000型接触式角膜内皮镜及角膜分析仪,观察、分析我国正常人角膜内皮细胞照片144张。结果表明:正常人角膜内皮细胞随年龄增长而趋向衰老的变化,显示了角膜内皮具有自我调整、功能代偿的本能。提出判定角膜内皮"愈合储备"功能标准应根据细胞密度和形态构型而定。