Myosin Va RNAi慢病毒载体的构建及对肺癌PG细胞运动和迁移能力的影响

目的构建人非常规肌球蛋白myosinVa基因RNAi慢病毒载体,并探讨其对人肺巨细胞癌PG细胞运动和迁移能力的影响。方法针对已经筛选确定的myosinVa基因RNAi有效靶序列,合成靶序列及其阴性对照的寡聚DNA,并连接到pSuper载体获得中间实验质粒pSuper-shM5A及阴性对照pSuper-shCON;然后将H1promoter-shM5A/shCON表达框重组到慢病毒载体plenti4上,分别得到plenti4-H1-shM5A和shCON载体,并进行慢病毒包装。随后用病毒上清感染PG细胞,并筛选出zeocin抗性的稳定细胞系PG-shM5A和shCON。通过RT-PCR方法检测PG-shM5A和shCON细胞的myosinVamRNA表达水平;用创伤愈合和Boyden小室实验测定PG-shM5A和shCON细胞的运动和迁移能力。结果限制性内切酶酶切和测序证实,成功构建myosinVaRNAi慢病毒载体plenti4-H1-shM5A。慢病毒包装成功后,感染PG细胞并获得zeocin抗性的细胞;用RT-PCR方法证明,myosinVamRNA被抑制70%以上。创伤愈合和Boyden小室实验表明,感染携带myosinVaRNAi慢病毒的PG细胞运动和迁移能力显著下调。结论成功构建myosinVaRNAi慢病毒载体plenti4-H1-shM5A,它能有效抑制人肺巨细胞癌PG细胞的myosinVa表达并降低其运动和迁移能力,初步揭示了myosinVa与肿瘤细胞恶性行为的相关性。