人HCN2基因编码的心脏起搏通道的电生理

目的将人超极化激活的阳离子通道基因2(human hyperpolarization-activated cation channel2,hHCN2)表达于HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点。方法利用全细胞膜片钳技术,记录转染了hHCN2的HEK293细胞上的超极化激活的阳离子流(If)。结果转染hHCN2的HEK293细胞上表达If样内向电流,在超极化时激活,随刺激电压的延长而增大,半数最大激活电压为(-109.1±0.7)mV,曲线斜率为(-12.7±0.7)mV。刺激电压变负时,激活变快。-100mV和-160mV时,激活时间常数分别为(2.5±1.1)s和(217±29)ms。此电流是细胞外钾离子浓度依赖性的,对钠离子和钾离子的相对通透性为0.67。2mmol/L的Cs+可明显抑制此电流。结论目的基因hHCN2在HEK293细胞上成功表达,表达的蛋白能形成有功能的通道,产生If样电流。

人胚肾(HEK293)细胞自身的钾通道

目的研究人胚肾(HEK293)细胞自身的电压依赖性的钾通道。方法利用全细胞膜片钳技术,记录HEK293细胞上的外向电流及其通道的电生理特点。结果HEK293细胞上未发现氯电流。59.7%的细胞表达一种类似瞬间外向钾电流(Ito)的钾电流,该电流对4-AP敏感,2mmol/L的4-AP可明显抑制此电流。在40mV时,此电流幅度为(175±112)pA。失活曲线显示其通道的半数失活电压为(-3.5±0.9)mV,斜率为(6.3±0.8)mV。该通道从失活状态中恢复的时间常数为(333.3±33.9)ms,其失活动力学曲线呈钟形。结论HEK293细胞自身存在Ito样电流,且此电压依赖性钾通道是其自身表达的最主要的有功能的离子通道,提示在利用此广泛应用的表达系统来研究外源性离子通道的时候,应该加倍注意。

HEK293细胞上表达的人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2和亚型4的电生理

目的将人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2(hHCN2)和亚型4(hHCN4)的基因表达于 HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点。方法包含目的基因 hHCN2或hHCN4的 cNDA 亚克隆到腺病毒穿梭载体 pAdTrack-CMV,穿梭载体和病毒骨架载体 pAdEasy-1在大肠杆菌重组,病毒经过包装和扩增后分别转染 HEK293细胞。利用全细胞膜片钳技术,记录分别转染了 hHCN2和 hHCN4的 HEK293细胞上的超极化激活钾电流(I_f)。结果转染 hHCN2和 hHCN4的HEK293细胞上产生超极化激活的内向电流。两种通道的半数最大激活电压分别为-114.8 mV±3.3 mV 和-125.9 mV±2.9 mV,反向曲线斜率分别为11.1 mV±1.2 mV 和13.7 mV±1.3 mV。两者的激活动力学明显不同,刺激电压为-110 mV 时,通道的激活时间常数分别为0.99 s±0.21 s 和8.47 s±2.85 s。两种通道对钠离子和钾离子的相对通透性分别为0.40和0.34。两种电流均可被2mmol/L 的氯化铯(CsCl)阻断。结论目的基因 hHCN2和 hHCN4在 HEK293细胞上成功表达,形成的两种通道具有明显不同的激活动力学。