从国际论文分析我国对人类新基因功能研究的贡献

自1990年人类基因组计划（human genomeproject，HGP）启动至2006年5月人类一号染色体的测序结束川标志着人类基因组计划的最终完成。伴随其他诸多物种基因组的解读，生物学和医学研究的重点也已转向功能基因组学，这是一个隐藏着巨大产业化潜能和经济效益并与人类健康息息相关的领域。据2008年人类基因及转录本数据库（H-invitational database，H．InvDB）统计，迄今已注释的人类编码基因为34057个，而有功能的基因只有12404个㈦。因此，大量人类新基因及其蛋白功能的开发研究仍有待于进一步发掘。

我国人类功能基因研究与开发策略

2003年在纪念DNA双螺旋结构发表50周年之际,由美、英、日、法、德和中国科学家经过13年努力绘制的人类基因组全序列图终于完成,以序列分析为主的人类基因组计划的目标已经实现.

细胞筛选平台在人类功能基因组研究中的应用

人类基因组全序列的精细图已完成,当前生命科学面临的重要任务就是如何将基因组序列信息转化为基因的功能信息,了解生命活动的分子机理,改善人类健康,为生物技术发展提供动力.在一系列功能基因组研究新技术中,高通量(high-throughput)和高内涵(high-content)的细胞筛选技术平台已经显示出巨大潜力,发挥着越来越重要的作用.通过在体外培养的哺乳动物细胞中基因过表达或抑制基因表达,分析所产生信号传导通路和/或细胞表型改变,可以直接发现基因功能.近年来一些技术上的进展,使细胞筛选平台具有微量、自动、高效、高通量,以及可以系统研究的特点,已经成为功能基因组研究的核心方法之一.近2￣3年来已经出现一批成功应用细胞筛选平台进行大规模功能基因组研究的报道.我国在这一领域的研究也开始起步,将对我国生物技术的源头创新研究产生深远的影响.

人类新基因C17orf32的电子克隆和编码区序列RT-PCR验证

利用生物信息学与实验验证的技术路线 ,成功地克隆了人类新基因C17orf32的cDNA (GenBank登记号 :AY0 74 90 7和TPA :BK0 0 0 2 6 0 ) ,发现C17orf32的完整开放阅读框架 (ORF ,31～ 6 5 7bp)cDNA (6 2 7bp)与人类假定基因LOC12 4 919ORF (2 5～ 80 7bp)的 2 5～ 6 5 1位只有一个碱基不同 .经RT PCR验证并cDNA测序、人类表达序列标签 (EST)数据库的BLAST检索和基因组成规律分析三方面的结果 ,均支持C17orf32的序列 ,而不支持LOC12 4 919的编码序列 .C17orf32基因组序列全长 4 6 10kb ,含有 6个外显子和 5个内含子 ,cDNA序列全长 16 79bp ,ORF横跨全部 6个外显子 .该基因ORF翻译起始处符合Kozak规则 ,ORF起始码上游同一相位有终止码 ,ORF后有 2个加尾信号和PolyA尾 .C17orf32基因的成功克隆表明 ,NCBIGENOMEAnnotationProject在 2 0 0 1年 12月预测的人类假定蛋白XP- 0 5 886 5编码基因LOC12 4 919的模式参考序列XM- 0 5 886 5中存在偏差 ,即在C17orf32基因cDNA的 4 0 6与 4 0 7位碱基之间错误插入一个碱基G ,从而导致在插入位点后 ,ORF编码 12 5位氨基酸以后蛋白质序列的改变 ,出现 2 6 0个氨基酸的多肽 .因此 ,应慎重看待计算机注释的人类基因组编码序列 .

人类SR蛋白超家族新成员——SFRS12(SRrp508)的基因克隆和特性分析

采用生物信息学方法克隆出全长 3811bp的人类RC5 0 8cDNA片段 ,经核酸和蛋白质分析为人类新基因 (Gen Bank登记号 :AF4 5 90 94 ) ,利用RT PCR方法从人类胰脏组织中扩增出包含编码 5 0 8个氨基酸残基最大开放读码框架 (ORF)的 16 80bpcDNA片段 ,经核酸测序证明与电子克隆结果完全一致。该基因具有启动子和TATA box,ORF前同一相位有多个终子码 ,后有加尾信号 ,显示为客观存在基因。该基因含有 12个外显子 (96～ 2 0 93bp)和 11个内含子 (14 0～ 5 15 3bp) ,定位于人类 5号染色体 5q11.2～q12 .1,无任何连锁基因存在。该基因ORF 342～ 186 8(15 2 7)横跨10个外显子 ,所编码 5 0 8氨基酸蛋白的全长序列与大鼠丝氨酸 精氨酸二肽富含性 (SR)剪切调控蛋白 86 (SRrp86 )高度同源 ,在核酸和蛋白水平的同源性分别为 84 %和 86 % ,与其他已知蛋白无论在核酸水平还是在氨基酸水平几乎均无整体的同源性。结果表明 ,所克隆的 5 0 8氨基酸蛋白才是大鼠SRrp86的人类同源物 ,从而修正了Barnard(2 0 0 0 )所指出的人类同源物为人类精氨酸富含性核蛋白 5 4 (p5 4 )这一论断 ,并提示它是日益增长的SR蛋白超家族的又一个新成员。该基因组织表达谱广泛 ,有可能具有转录因子活性 ,暂命名为SR相关剪切调控蛋白 5 0 8(SRrp5 0

Chitosan-DNA介导关节基因转移的体外研究

目的 :探索体外Chitosan对关节软骨细胞、滑膜细胞的转染。方法 :分离培养兔正常滑膜细胞、软骨细胞 ,使用荧光质粒 pEGFP -C3作为报道基因 ,制备Chitosan -DNA超微颗粒转染兔正常软骨细胞、滑膜细胞 ,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果 :Chitosan能将DNA带入胞内 ,该DNA超微颗粒随时间的延长可缓慢进入胞内 ,其包被的DNA也可以被缓慢释放 ,且对软骨细胞的转染能力强。结论 :Chitosan在体外可介导关节软骨细胞、滑膜细胞基因转移 ,为今后关节疾病非病毒基因转移的研究提供实验依据。

新细胞因子及细胞凋亡基因的发现与功能研究

在人类基因组完成工作框架图以后 ,人类功能基因组学成为最重要的任务之一。我们目前正在重点研究编码细胞因子和凋亡相关分子的人类功能基因。本综述介绍其中的 2个首先由我们实验室克隆的分子 ,即趋化素样因子 1(CKLF1)和程序化细胞死亡分子 5 (PDCD5 ,过去命名为TFAR19)。CKLF1是属于一个新的基因超家族的成员 ,具有体内外对不同白细胞的趋化活性、刺激骨骼肌增殖活性和刺激骨髓细胞增殖活性。在临床应用上 ,重组CKLF1蛋白质有可能用于肌萎缩的治疗 ,CKLF1抑制剂有可能用于变态反应和自身免疫病的治疗。PDCD5是凋亡的正调节分子 ,能够结合胱天蛋白酶 3,并在体外延长其半衰期。较多证据表明 ,PDCD5在肿瘤组织的表达低于正常组织。PDCD5有可能成为肿瘤。

电脉冲介导hIL-10基因转移治疗骨关节炎的实验研究

目的 研究电脉冲介导人白细胞介素10裸质粒肌肉注射对骨关节炎的治疗作用。方法 兔右膝关节髌旁内侧切口,行内侧半月板切除术制作骨关节炎模型,4周后按分组于右侧股四头肌注射pcDI或pcDI-IL10质粒,然后立即于注射部位施以电压200v(电极间距离为1cm),波宽40ms,脉冲次数6次和频率1Hz的电脉冲。共注射2次,每次间隔2周。按分组情况分别于术后4周、8周处死动物,行解剖显微镜观察及关节软骨、滑膜病理检查。结果 pcDI-IL10质粒注射组的关节软骨破坏程度较注射pcDI组轻(P<0.01),而较4周处死组稍重。结论 电脉冲介导肌肉pcDI-IL10转移可以延缓骨关节炎的发展。

基因治疗的新型载体研究进展

建立和发展一个安全及有效的载体系统对基因治疗是极其重要的。尽管病毒载体已经在临床上用于基因治疗 ,但其安全性仍然不确切。近年来 ,许多非病毒性基因载体系统已被广泛开展及应用。本综述将讨论一些新的基因载体系统 ,特别是本实验室开展研究的载体系统 ,包括细胞转导肽、电脉冲导入系统。

促细胞增殖新基因TOX的功能研究

利用GenBank中的数据,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)从人的cDNA文库中克隆得到功能基因TOX(thymocyte selection-associated high mobility group box),运用生物信息学分析其结构特性,并通过逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)分析TOX在细胞系中的表达;利用荧光显微镜观察其亚细胞定位情况;使用细胞生长曲线实验和流式细胞术分析TOX对细胞增殖及细胞周期的影响.结果表明:TOX基因定位于人8号染色体q12.1上,全长4 131bp,编码526个氨基酸,该蛋白质分子质量约为57ku,含有9个外显子和8个内含子,其编码蛋白为高迁移率蛋白家族成员,能参与基因调控等生理过程;TOX基因在白血病细胞系Jurkat和Raji中高表达,并定位于细胞核中;对细胞生长曲线绘制及细胞周期分析表明,TOX能够使细胞生长速度加快,且S期细胞比例明显上升.说明TOX参与了细胞增殖调控,有可能研究开发为药物靶标或疾病标志物.

NF-κB_3结合位点在人TNF-α基因转录调节作用中的研究

目的 :探讨TNF α启动子中 3个κB位点在调节基因转录中的作用及其与核蛋白作用的亲和力关系。方法 :用含不同调节区域的重组报告基因进行HL 6 0细胞的基因转染 ,检测LPS刺激前后及κB3 反义寡核苷酸封闭后的报告基因表达水平 ;提取LPS刺激 6h的HL 6 0的细胞核蛋白 ,用凝胶迁移率改变实验及竞争结合实验比较NF κB与TNF α的 3个NF κB位点的亲和力。结果 :尽管TNF α基因中 3个κB位点都参与该基因的诱导和非诱导性转录调节 ,但κB3 位点的作用更为重要 ;3个κB位点能同LPS刺激和非刺激的HL 6 0细胞核蛋白发生特异性结合 ,但LPS刺激的蛋白 DNA复合物电泳条带明显增粗 ,尤其κB3 位点出现 2条明显的特异性条带 ;3个κB位点与LPS诱导后HL 6 0核蛋白的亲和力强弱顺序依次为 :κB2 >κB1 >κB3。结论 :TNF α基因的 3个κB位点都能与NF κB结合 ,从而参与调节HL 6 0细胞TNF α组成性表达和LPS诱导性表达。尽管κB3 位点在对LPS刺激的反应性中发挥的作用最大 ,但这种效应与其同核蛋白亲和力的大小无关。

人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。

Ig启动子有效启动肿瘤抑制基因的表达研究

免疫球蛋白(Ig)启动子在多种上皮性肿瘤细胞具有高启动活性。采用PCR方法获得了Ig重链VH6-1启动子,用该启动子DNA序列替换真核表达载体(PDC316)中巨细胞白血病病毒启动子(CMV)序列,构建了Ig启动子/人增殖抑制基因(hHSG)/PDC316表达载体。结果显示,与CMV启动子相比,Ig启动子能够更有效地启动hHSG基因的表达,并显示其生长抑制作用和诱导凋亡作用。提示Ig启动子可作为肿瘤靶向治疗载体中的启动子,在肿瘤基因治疗研究中具有较好的应用前景。

C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(CTRP6)参与免疫及相关疾病的研究进展

新型脂肪因子C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(CTRP6)属于CTRP家族成员,在人类和小鼠多种组织中广泛表达。与其他CTRP一样,CTRP6由N端信号肽、短的可变区、胶原结构域和C端C1q球状结构域四部分组成,其结构在进化过程中高度保守。CTRP6参与多种炎症过程,在炎症调节、脂肪组织炎症、类风湿性关节炎(RA)、炎症性肾损伤、血管内皮炎症和肿瘤发生发展过程中起重要作用。我们主要对CTRP6的结构、表达分布及其参与免疫及相关疾病的研究进展进行总结。

人增殖抑制基因(HSG)对肿瘤细胞系化疗敏感性的作用

目的:将人增殖抑制基因 (hHSG)用电子穿孔的转基因方式转染到体外培养的人肿瘤细胞系中,观察hHSG基因对内源性hHSG表达水平不同的肿瘤细胞系的化疗敏感性的影响。方法:首先用免疫组化方法检测不同组织来源的肿瘤细胞系中hHSG的表达水平,然后选择内源性hHSG表达水平较低的肺腺癌 (A549 )和内源性hHSG表达水平较高的宫颈癌(HeLaS3)细胞系,用电穿孔方法转染含有hHSG的真核表达载体 (pEGFP hHSG) 24h后,加入放线菌酮(CHX),采用细胞计数、MTT法观察hHSG对肿瘤细胞增殖抑制作用及对CHX的化疗敏感性的影响。结果:hHSG在不同组织来源的肿瘤细胞系都有不同程度的表达, pEGFP hHSG转染到两种内源性hHSG表达水平不同的肿瘤细胞系后,这两种肿瘤细胞的生长增殖都明显受到抑制,同时外源性的hHSG也增强了这些肿瘤细胞系对CHX的敏感性。结论:外源性hHSG可不依赖其内源性表达水平而抑制肿瘤细胞的增殖,与CHX并用可增强肿瘤细胞对CHX的敏感性,具有协同作用。

程序化死亡基因5(PDCD5)在骨关节炎软骨中的表达及意义

目的 :研究程序化死亡基因 5 (PDCD5 )在正常及骨关节炎关节软骨中的表达规律 ,探讨PDCD5在骨关节炎发病中的作用。方法 :取 2 0例骨关节炎及 10例股骨颈骨折行关节置换术时切除的关节软骨 ,分离软骨细胞 ,留取组织块制作石蜡切片。分别用流式细胞术、直接免疫荧光、激光共聚焦显微镜及RT -PCR检测PDCD5在正常及骨关节炎软骨细胞内的表达水平及部位 ,免疫组织化学检测PDCD5在关节软骨内的表达特征。结果 :在骨关节炎软骨细胞中PDCD5表达上调 ,以细胞核内增强为主 ;在骨关节炎的组织切片中PDCD5表达增强 ,阳性细胞主要分布在表层及深层 ,而在股骨颈骨折中PDCD5阳性细胞主要分布在表层及中层。结论 :PDCD5可能参与了骨关节炎软骨细胞的凋亡过程 。