医学细胞生物学教学的困惑与改革探索

医学细胞生物学既是生命科学中的前沿学科，又是临床医学重要的基础学科。医学细胞生物学是讲授细胞的结构和生命活动的基本规律及其机理，医学生只有掌握正常细胞的生命活动，才能够认识疾病发生的本质。本文探讨了医学细胞生物学的教学现状和困惑，提出了提升学生的学习兴趣、采用多种教学方法以提高教学质量、将科研思想融入教学和吸引学生参与科研以培养创新人才的改革措施。

α-硫辛酸对在H9c2细胞在H_2O_2导致的氧化应激损伤中的保护作用

缺血再灌注产生的氧自由基会导致心肌细胞凋亡.近年研究发现,α-硫辛酸(α-lipoic acid,LA)具有抗氧化作用,但LA是否能够对抗心肌细胞凋亡,保护心脏功能的作用尚未明确.本研究利用H2O2诱导的心肌细胞H9c2氧化应激模型,分别用CCK-8方法检测细胞存活率、Hoechst33342染色观察细胞核的形态变化、流式细胞术检测细胞凋亡率、real-time PCR法检测Bcl-2/Bax基因表达变化,评价LA是否具有对抗氧化损伤引起的心肌细胞凋亡能力.结果显示,LA能提高H2O2损伤的H9c2细胞存活率,降低心肌细胞凋亡,而且LA通过上调Bcl-2的表达而发挥抑制细胞凋亡的作用.研究结果证实,LA对氧化应激损伤的心肌细胞具有较好的保护作用.该研究为LA在临床上用于治疗氧化应激引起的心肌细胞凋亡提供了实验依据.

NF1～180mut表达载体构建及其在脑血管细胞中的表达

目的前期研究中发现一合并脑血管狭窄的Ⅰ型神经纤维瘤病家系,为探索血管狭窄的病因,本研究构建该家系患者NF1基因共同突变产物NF1~180mut的过表达质粒,观察该质粒在脑血管细胞中的表达。方法设计NF1~180mut全长序列的相应引物,采用p EGFP-N1作为载体框架,构建p EGFP-N1/NF1~180mut表达载体,通过Western blot法及共聚焦检测其蛋白表达;之后采用脂质体转染重组质粒于脑血管平滑肌细胞或内皮细胞中观察NF1~180mut在两种脑血管细胞中的表达。结果(1)成功构建了NF1~180mut表达载体;(2)该表达载体可在脑血管内皮细胞及平滑肌细胞内表达;(3)初步通过细胞计数研究及增殖实验显示NF1~180mut对脑血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的生长及增殖有一定的作用。结论本研究中构建了NF1-Q181X突变后的产物NF1~180mut表达载体,为进一步深入研究NF1~180mut导致脑血管狭窄发生的通路提供了良好的体外研究工具。

人胚胎脑室脉络丛上皮细胞表达神经干细胞分子标志

目的探讨人12周龄胚胎脑脉络丛上皮细胞是否具有神经干细胞的生物学特性。方法制备室管膜/室管膜下区和纹状体脑切片和脉络丛组织铺片,采用免疫荧光染色,在激光扫描共焦显微镜下观察结果,采集图像数据。结果人12周龄胚胎脑室脉络丛上皮细胞表达神经干细胞分子标志CD133、Nestin和Sox2。神经干细胞的分子标志在脉络丛上皮细胞的分布具有一定极性,未见共定位分布。室管膜上皮细胞面向脑室腔面的细胞顶端微绒毛也表达CD133,而室管膜下区和纹状体区可见极少数CD133阳性标记细胞。结论 12周龄脑室脉络丛上皮细胞已定向分化,不仅提供维持神经干细胞的微环境,还具有神经干细胞的生物学特性。

碱性成纤维细胞生长因子和环磷酸腺苷对神经前体细胞内源性端粒酶反转录酶基因转录水平的调控

目的探讨人类神经前体细胞中内源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的转录活性及增殖与分化相关调控机制。方法采用系列hTERT基因启动子的荧光素酶报告载体和β-半乳苷酶表达载体,瞬时共转染HeLa细胞和hNPCs-G3细胞,检测不同长度启动子的活性。分析碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进增殖过程中hTERT基因启动子活性,分析cAMP诱导分化过程中hTERT基因启动子活性。结果 hNPCs-G3神经前体细胞内源性hTERT基因的转录活性较低,主要依赖近端启动子区。bFGF上调hNPCs-G3神经前体细胞内源性hTERT基因的表达,其调控主要作用在-2 098～-1 099bp区域和-3 216bp～-2 098bp区域内;cAMP抑制hNPCs-G3神经前体细胞hTERT基因的转录,其调控主要作用在近端启动子区。结论神经前体细胞内源性hTERT基因的转录活性较低,bFGF可上调神经前体细胞内源性hTERT基因的表达,cAMP则可抑制hTERT基因的转录。

视网膜色素上皮细胞脱离体外培养条件后细胞保存液的研究

目的研究人视网膜色素上皮细胞(hRPE细胞)离体或脱离体外培养条件后,维持细胞活性、且延长细胞存活时间最适宜的液体。方法将5代以上hRPE细胞(本实验室保存)按常规冷冻、复苏培养于DMEM/F12培养基添加10%胎牛血清,EGF20μg/L和bFGF20μg/L条件下,至80%以上汇合,经胰蛋白酶消化,收集细胞、计数,置于6种不同保存液中(平衡盐液、Quinn’sadvantage medium、生理盐水、18氨基酸液、5%葡萄糖液和人工脑脊液),用Annexin V/FITC Kit染色,利用流式细胞术(FACS)检测细胞死亡或凋亡。采用2h至8h之间3个时间点,检测hRPE细胞在6种不同细胞保存液中的细胞状态。结果室温状态下,hRPE细胞30min内均发生坏死。4℃状态下,2h平衡盐液组凋亡率最低(0.9%);各组分别与平衡盐液组相比,显示人工脑脊液组与平衡盐液组之间存在显著差异;4h至8h,hRPE细胞凋亡率从26.74%上升至41.36%。各组总死亡率与凋亡率基本一致。结论4℃状态下,6种溶液中,平衡盐液是维持hRPE细胞脱离培养条件后保持细胞活性,且延长细胞存活时间最适宜的溶液。

shRNA腺病毒介导的JNK1 RNAi抑制U87MG人胶质瘤细胞的增殖

目的研究腺病毒介导的shRNA对U87MG人胶质瘤细胞JNK1基因表达的抑制作用,以及对细胞增殖的影响。方法设计合成针对JNK1基因以及无义对照的shRNA序列,通过腺病毒介导shRNA的表达来下调JNK1的表达;Q-PCR和Western blot验证病毒效果;用BrdU掺入的方法来检测细胞的增殖情况。结果限制性酶切及DNA测序结果证实shRNA插入片段完全正确;Q-PCR和Western blot结果表明JNK1的表达与对照组相比明显下降;BrdU掺入结果表明Ad-shJNK1处理组细胞增殖显著降低。结论重组的JNK1shRNA腺病毒构建成功,JNK1的下调明显抑制了细胞的增殖,为深入研究JNK信号通路在神经肿瘤中的作用奠定基础。

血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源神经干细胞增殖的促进

目的:观察血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源的神经干细胞增殖的促进作用,为临床治疗提供实验依据。方法:实验于2003-10/2005-05在北京大学医学部干细胞研究中心完成。小鼠胚胎干细胞在不含有白细胞抑制因子的条件下形成类胚体,经过7d选择性培养得到神经干细胞,利用免疫荧光的方法检测神经干细胞标志物nestin以及sox-2的表达情况;将神经干细胞与血管内皮生长因子共培养,通过氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入的方法测定细胞的增殖速度;在外源性血管内皮生长因子存在的情况下,利用受体2中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体,观察外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结果:经鉴定胚胎干细胞来源的神经干细胞(95±3)%以上表达神经干细胞标志物nestin以及sox-2,该细胞在体外可以传代。与血管内皮生长因子共培养后,发现随着血管内皮生长因子浓度的升高神经干细胞增殖速度明显加快。通过中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体2可以阻断外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结论:实验中诱导小鼠胚胎干细胞得到了高纯度的神经干细胞,血管内皮生长因子能够通过血管内皮生长因子受体2促进神经干细胞增殖。

唾液酸粘蛋白单抗5E2、6C10的制备、鉴定及对胃肠癌糖链表达规律的初步探讨

目的 寻找识别新的肿瘤相关粘蛋白抗原的单抗,为阐明胃肠癌粘液糖蛋白的表达规律进而为胃肠肿瘤的预后、分型等提供参考依据。方法 以牛颌下腺粘蛋白(BSM)为免疫原免疫小鼠,以免疫脾细胞与Sp2/0细胞融合建立杂交瘤细胞株,用有限稀释法克隆化,间接ELISA及间接ELISA结合神经氨酸酶消化筛选克隆。以聚丙烯酰胺凝胶电泳,免疫印记(Western-Blot),间接ELISA结合热处理、胰蛋白酶消化、过碘酸氧化以及稀碱处理去除O-乙酰基等方法进行抗体的鉴定。以免疫组化LSAB法观察两株抗体对68例胃癌和55例肠癌粘蛋白糖链抗原的标记情况。结果 两株抗体分别命名为5E2和6C10,Western-Blot显示两株抗体均只与分子量大于220kDa的PAS染色阳性条带反应。两株单抗与BSM的反应都对热处理、胰蛋白酶消化、过碘酸氧化、神经氨酸酶消化等处理敏感。5E2还对稀碱去除O-乙酰基敏感,6C10可以部分吸收sialyl-lewis^a。单抗6C10在早期胃癌及癌旁的阳性率分别为5.5％和52.9％,进展癌及其癌旁的阳性率分别为14.0％和22.9％;在结肠癌及其癌旁的阳性率分别为30.9％和83.8％。单抗5E2在胃早期癌及其癌旁的阳性率分别为16.7％和41.2％,在进展癌及其癌旁的阳性率分别为42.0％和37.5％;在肠癌及其癌旁的阳性率分别为69.1％和91.9％。结论

苯丙酮尿症患者病情控制前后血清氨基酸含量比较

目的:观察经治疗病情得到控制的苯丙酮尿症患者血清中支链氨基酸与芳香族氨基酸的变化,及与正常人群的区别。方法:实验于2005-12在北京大学医学部基础医学院细胞生物学系完成。选择山西省妇幼保健院提供的10例苯丙酮尿症患者为实验对象。年龄8个月～10岁,均为男性。根据新生儿疾病筛查方法,婴儿出生72h取足跟部血,发现血液苯丙氨酸浓度>120μmol/L时,诊断为苯丙酮尿症。均无并发症和其他基础疾病。由院方告之家长同意后取血。体质量均正常。治疗根据患者不同年龄,分别采用国产低(无)苯丙氨酸蛋白质、低(无)苯丙氨酸配方奶粉、低(无)苯丙氨酸的特殊营养食品,来控制苯丙氨酸的摄入量。于治疗前后进行血清氨基酸测定。结果:10例患者的测试数据均进入结果分析。10例患者治疗后病情得到控制的患者其苯丙氨酸水平较治疗前下降,未达到正常值但在理想范围之内,酪氨酸正常或上升,支链氨基酸与芳香族氨基酸的比值高于治疗前,但仍低于正常值[苯丙氨酸:正常值:(0.07±0.00)mmol/L,治疗前:(1.56±1.51)mmol/L,治疗后:(0.09±0.16)mmol/L;酪氨酸:正常值:(0.06±0.02)mmol/L,治疗前:(0.22±0.06)mmol/L,治疗后:(0.08±0.04)mmol/L;支、芳比值:正常值:>3.00±0.06,治疗前:0.47±0.21,治疗后:1.44±0.24,治疗后与治疗前比较,P<0.05]。结论:经治疗后的苯丙酮尿症患者血清氨基酸水平有明显改变。提示氨基酸代谢异常征,当其做为病因的主要氨基酸达到理想水平后,其余氨基酸的比例与正常值的比较,是否是此类疾病所特有的,与其他疾患的关联性以及其临床意义,应需进一步研究。

奶牛排卵前后宫颈粘液中氨基酸含量的变化

为了研究母体排卵前后受精环境的变化，测定了27头奶牛排卵前和排卵后宫颈粘液中的氨基酸含量，测定结果表明，宫颈粘液的氨基酸含量排卵前平均为1032μg/mL，排卵后平均为2380μg/mL，排卵后为排卵前的2．3倍（Table 1)。排卵前，宫颈粘液中含量比例最高的氨基酸是谷氨酸和苏氨酸，分别占氨基酸总量的12．8％和12．2％，含量比例最低的最组氨酸，只占2．2％，这种比例在排卵前后都是比较稳定的（Table2)。排卵后，宫颈粘液中氨基酸比较普遍下降的是苏氨酸，比排卵前平均下降19％，排卵后普遍增加的是赖氨酸，比排卵前平均增加25％（Table 3)。Fig.1表明：排卵前后，宫颈粘液中均不含游离氨基酸。体液中的氨基酸代谢是一种重要的生理活动，排卵后宫颈粘液中苏氨酸含量普遍降低，赖氨酸含量普遍增加的生理活动反映了这些氨基酸相关的蛋白成分发生了变化，这些蛋白成份的变化有否生理意义，是否对卵与X或Y精子的结合产生影响，有待深入研究。

氯化钆对糖尿病小鼠模型的降糖作用

在离体培养人胰腺前体细胞时在培养基中加入GdCl3,观察发现GdCl3能够使人胰腺前体细胞聚集,在诱导因子共同存在下,进一步诱导人胰腺前体细胞成为胰岛样结构。用STZ诱导小鼠构建I型糖尿病小鼠模型。当每4 d给I型糖尿病小鼠腹腔注射GdCl3溶液,25 d后观察到小鼠的空腹血糖值明显降低,IPGTT试验结果显示,小鼠糖代谢得到明显改善。结果表明,可能的机制为:GdCl3通过促进胰腺干细胞分化成为成熟的胰岛素分泌细胞,增加内分泌细胞的数量,从而促进受损胰腺的再生与修复,起到降低糖尿病小鼠血糖水平的作用。

实体瘤CAR-T治疗的挑战与展望

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)治疗是通过体外改造T细胞,使其能特异性识别和杀伤肿瘤细胞,从而达到肿瘤治疗目的的一种新技术。目前,CAR-T治疗相关的临床试验正在全世界范围内广泛开展,CD19靶点的CAR-T在治疗血液肿瘤方面取得了革命性的成功,CAR-T疗法正成为继手术、放疗、化疗之后的又一新的肿瘤治疗方法。然而,对于癌症中的主要类型实体瘤,目前CAR-T治疗的研究依然缺乏实质性进展。本文以实体肿瘤的CAR-T治疗为切入点,简要概述了实体肿瘤相较于血液肿瘤的特征和治疗难点,以及目前CAR-T治疗实体瘤面临的主要挑战及展望。

脑胶质瘤太赫兹全息成像探索

太赫兹波(terahertz,THz)是宏观经典理论向微观量子理论的过渡区,也是电子学向光子学的过渡区,称为电磁波谱的“太赫兹空隙(THz gap)”,由于其独特的波谱特征,使得它在生物医学研究中成为研究热点。脑胶质瘤疾病是一种高发性的神经肿瘤疾病,对于它的早期诊断和早期治疗是脑胶质瘤患者获得良好预后的关键。本研究即采用大鼠C6脑胶质成瘤模型,利用太赫兹波对其皮下和颅内成瘤组织的冰冻切片进行波谱特征分析,同时利用太赫兹全息成像技术对其进行成像分析,对比研究不同厚度病理组织切片的波谱特征差异、对比正常组织和成瘤组织的波谱特征差异及其太赫兹全息成像结果,从而为实现太赫兹全息成像技术在生物医学检测应用方面奠定研究基础。

钙周期素结合蛋白促进非小细胞肺癌增殖和侵袭

目的探讨钙周期素结合蛋白(CacyBP)对非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其分子机制。方法选取2016年于济南市中心医院行手术治疗的非小细胞肺癌患的肺癌组织和正常癌旁组织标本各6例,采用Western blot法检测肺癌和正常癌旁组织中CacyBP蛋白的表达水平,Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测正常支气管上皮细胞16HBE和不同非小细胞肺癌细胞系(A549、H1299、H460和H1975)中CacyBP蛋白和mRNA的表达水平。将siRNA、siCacyBP-1、siCacyBP-2、慢病毒包装质粒shNC和shCacyBP转染至A549细胞(分别记为siNC组、siCacyBP-1组、siCacyBP-2组、shNC组和shCacyBP组),将对照质粒和Flag-CacyBP质粒转染至A549细胞(分别记为NC组和Flag-CacyBP组)。采用细胞计数试剂盒8法、平板克隆实验以及流式细胞术检测细胞增殖能力以及细胞周期情况,细胞划痕和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot法检测敲低或过表达CacyBP A549细胞中E-cadherin、N-cadherin、Snail1、Vimentin和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表达。结果 CacyBP蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达水平为0.41±0.23,高于正常癌旁组织(0.11±0.04,P<0.05)。不同非小细胞肺癌细胞系(A549、H1299、H460和H1975)CacyBP蛋白的表达水平分别为0.35±0.01、0.38±0.01、0.32±0.01和0.41±0.01,均高于16HBE细胞(0.03±0.01,均P<0.05);RT-PCR结果与Western blot结果一致。与siNC组[吸光度(A)值为1.54±0.03]比较,siCacyBP-1组和siCacyBP-2组细胞增殖能力降低(分别为1.38±0.04和1.34±0.03,均P<0.05)。shNC组细胞克隆形成数为(41.33±3.21)个,高于shCacyBP组[(22.00±3.61)个,P<0.05]。shCacyBP组细胞G1期占比为(61.35±5.45)%,高于shNC组[(49.61±1.54)%,P<0.05];S期占比为(25.41±3.21)%,低于shNC组[(38.68±0.46)%,P<0.05]。shCacyBP组细胞迁移率为(12.67±0.71)%,低于shNC组[(35.50±2.07)%,P<0.05]。shNC组细胞迁移和侵袭的数量分别为(406.33±7.37)个和(92.33±8.50)个,高于shCacyBP组[分别为(224.67±10.01)个和(66.00±7.94)个,均P<0.05]。与siNC组相比,敲低CacyBP的表达,E-cadherin的表达水平升高,N-cadherin、Vimentin、Snail1和p-Akt的表达水平降低(均P<0.05)。与NC组相比,Flag-CacyBP组E-cadherin的表达水平降低,N-cadherin、Vimentin、Snail1和p-Akt的表达水平升高(均P<0.05),PI3K/Akt通路抑制剂LY294002可逆转上述结果。结论 CacyBP通过调控Akt通路的活性促进非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭。