人肝细胞癌及其配对非癌肝组织、正常肝组织中热休克蛋白Hsp90基因mRNA水平的分析

为定量分析和比较 2 2对人肝细胞癌 (HCC)及其配对非癌肝组织 (PNL)和 2例正常肝 (NL)组织中热休克蛋白Hsp(heatshockprotein) 90基因mRNA的表达水平 ,用狭缝杂交法检测hsp90 βmRNA的表达 ;并进一步用以特异性复合cRNA为内参照的定量RT PCR法对hsp90α和hspβmRNA的表达进行分析比较 .狭缝杂交结果显示 ,hsp90 βmRNA在 1 3例 ( 59 1 % )PNL中的表达平均升高至NL的 1 87倍 ;在 2 1例 ( 95 5% )HCC中的表达平均升高至NL的 3 45倍 ;在 2 0例 ( 90 9% )HCC中的表达平均升高至PNL的 2 75倍 .以cRNA为内参照的mRNA定量RT PCR结果显示 ,hsp90αmRNA在1 8例 ( 81 8% )PNL中的表达平均升高至NL的 3 0 6倍 ;在全部 2 2例HCC中的表达平均升高至至PNL的 2 0 8倍和NL的 5 1 0倍 .hsp90 βmRNA仅在小部分 ( 8例 ,36 4% )PNL中的表达轻度升高至NL的 1 2 7倍 ,而在全部 2 2例HCC中的表达显著升高至PNL的 2 95倍和NL的 2 52倍 .hsp90α和hsp90 β可能分别在人HCC发生、发展的不同阶段发挥不同的作用 ;以cRNA为内参照的定量RT PCR法是较狭缝杂交法更为灵敏、准确和快捷的mRNA定量分析方法 .

用荧光差异显示法分离新的肝细胞癌相关基因

目的 :寻找新的肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)相关基因。方法 :应用荧光 差异显示 (fluorescentdifferentialdisplay)技术分析人HCC、配对非癌肝、胎肝、正常肝等组织之间的基因差异表达 ,差异表达cDNA片段 ,经测序后 ,再用RNA狭缝杂交对部分差异片段在上述 4种组织中的表达进行验证。结果 :共得到差异表达cDNA片段 110条。经狭缝杂交筛选 ,获得了 4条阳性片段 ,未知cDNA片段L2和与人醛缩酶B 99.5 %同源的cDNA片段L7在部分HCC中特异性低表达 ,未知cDNA片段LC2 7和与人Nip3基因 99.4%同源的cDNA片段LC2 0在部分HCC中特异性高表达。结论 :确认了 4条HCC相关基因。其中L2和人醛缩酶B基因可能为阻抑HCC发生、发展的基因 ,而人Nip3基因和LC2 7可能为促进HCC发生、发展的基因。L2和LC2 7为目前未知的新基因。

LHScDNA的部分克隆及其表达对肝癌细胞行为的影响

目的 :克隆在肝癌组织中低表达的差异显示片段L2的基因cDNA序列 ,并初步探讨其在肝癌发生、发展过程中的作用。方法 :将L2在GenBank中拼接后 ,分析其序列结构 ,并构建正义真核表达质粒 ,转染BEL 740 2肝癌细胞后 ,对转染细胞增殖、粘附、迁移和侵袭等指标进行测定。结果 :克隆得到一条 10 0 5bp的cDNA ,其 5′端 712bp与人Liprinβ1cDNA 5′端调控序列和外显子 1,2 ,3序列同源 (10 0 % ) ,而 3′端 2 93bp与Liprinβ1基因内含子 4同源 (10 0 % )。其间有一个 5 10bp开放阅读框架 ,起始密码位置与Liprinβ1基因相同 ,推断的蛋白产物除C端 13个氨基酸残基外 ,其余均与Liprinβ1同源。此cDNA暂命名为LHS (Liprinβ1 homologoussequence)。LHScDNA正义转染BEL 740 2肝癌细胞系 ,对于细胞的增殖活性和侵袭能力无明显影响 ,但可降低肝癌细胞在层粘连蛋白上的粘附和迁移能力。结论

人肝细胞癌相关新基因的筛选

目的 :寻找肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)相关的新基因 ,并从分子水平进一步探讨HCC发生发展的机制。方法 :对通过荧光 差异显示 (fluorescent differentialdisplay ,FluoroDD)技术从人HCC组织、配对非癌肝 ( pairednon cancerousliver,PNL)组织、胎肝 (fetalliver ,FL)组织和正常肝 (normalliver ,NL)组织获得的 110条差异表达cDNA片段 (DD片段 )中的 2 5条进行测序 ,将测序结果在GenBankNR数据库中进行同源性分析 ,并对其中 12条DD片段用RNA狭缝杂交法验证其在HCC、PNL及NL组织中的表达规律。结果 :2 5条DD片段中 18条与已知基因具有高同源性 ( >96 % ) ;5条与已知序列 (基因结构与功能未知 )具有高同源性 ( >85 % ) ;2条与Gen BankNR数据库中的序列无明显同源性。RNA狭缝杂交筛选到 5条在HCC中特异性高或低表达并与已知哺乳类动物基因高度同源 ( 97%～ 99% )的cDNA片段 :在HCC中特异性高表达的 3条片段是LC13(人热休克蛋白 90 β)、LC2 1(智人异源性核内核糖核蛋白C)和LC2 2 (干扰素诱导的智人鸟嘌呤结合蛋白 2 ) ;在HCC中特异性低表达的 2条片段是LC5 (智人甲状腺激素受体相关蛋白 2 40 )和FL2 5 (分化相关基因 1)。结论 :新发现 5条与HCC相关、与已知哺乳动物基因高度同源的cDNA片段。

层粘连蛋白总糖肽抗癌细胞转移机制的研究

从癌细胞增殖、凋亡和基质金属蛋白酶 (matrixmetalloproteinases,MMPs)的分泌等方面研究层粘连蛋白总糖肽 (laminin glycopeptides,LN GPs)抗癌细胞转移的机制。 方法 :将人肝癌细胞系Bel740 2细胞于层粘连蛋白基质上孵育一定时间后 ,噻唑蓝比色法测活细胞群体总数。3H TdR参入法测癌细胞DNA的合成 ;荧光素活化的细胞分拣术 (fluorescentactivatedcellsorting ,FACS)测定细胞周期 ;细胞经吉姆萨染色后计数有丝分裂指数 ;FACS和丫啶橙染色法检测细胞的凋亡。明胶酶谱分析法检测无血清培养上清中癌细胞分泌MMPs的水平。糖肽组加LN GPs (5 0mg·L-1)。结果 :癌细胞孵育后 ,活细胞群体总数增加 ,3H TdR的参入升高 ,G1期细胞减少而S期细胞增加。相反 ,加LN GPs组活细胞群体总数明显降低 ,3H TdR的参入下降 ,G1期细胞增加而S期细胞减少 ,与未包被组结果相近。但两种方法均未检测到明显的癌细胞凋亡。LN GPs组人肝癌细胞系Bel740 2细胞和高转移潜能的人巨细胞肺癌细胞系PG细胞的MMPs分泌和活化明显降低。结论 :LN可促进癌细胞的增殖 ,而LN GPs能抑制这一作用 ,并可明显抑制癌细胞MMPs的分泌 ,这可能是其抑制癌细胞侵袭和转移的重要环节。

层粘连蛋白总糖肽的抗癌细胞转移作用及其作用机制

增殖失控及侵袭与转移是恶性肿瘤细胞的根本特性,也是夺去癌患者生命的根本原因。不单在癌症发展过程中可自发的发生广泛转移,而且在癌症常规诊疗过程中也有可能人为的促进癌细胞的转移(医源性转移),如诊疗操作中的种植及对患者免疫功能的损伤等。癌细胞转移是一个多步骤的复杂过程。然而。

骨髓造血干祖细胞改善慢性约束应激诱导的小鼠脾细胞数减少

目的观察CD34+骨髓造血干祖细胞(CD34+HSPC)对慢性约束应激小鼠脾细胞数的影响。方法将10只8周龄雄性BALB/c小鼠分为2组(n=5):①慢性应激组:小鼠放入约束应激管中约束12 h/d(早9:00-晚9:00),解除约束12 h/d(晚9:00-早9:00),连续处理3 d以建立慢性约束应激的小鼠模型;②对照组:正常饲养不施加任何处理。慢性应激第3天结束时即取每组小鼠脾并计数脾细胞。HSPC体内干预实验中,20只雄性BALB/c小鼠分为4组(n=5):HSPC干预+慢性应激组,溶剂对照+慢性应激组,HSPC干预组和溶剂对照组。HSPC干预+慢性应激组和溶剂对照+慢性应激组慢性应激第3天结束时即取每组小鼠脾并计数脾细胞,流式细胞术检测其中活细胞、凋亡细胞及坏死细胞比例。绿色荧光标记HSPC做体内示踪试验,检测迁移至脾的HSPC。HSPC体外干预实验中,细胞培养分为4组:HSPC干预+地塞米松组,脾细胞+地塞米松组,HSPC干预组和脾细胞单独培养组,培养18 h,流式细胞术检测其中活细胞、凋亡细胞及坏死细胞的比例。结果脾细胞计数结果表明,与对照组相比,慢性应激组小鼠的脾细胞总数显著减少(P<0.05)。HSPC体内干预实验中,与溶剂对照+慢性应激组相比,HSPC干预+慢性应激组小鼠脾细胞计数增加(P<0.05)。流式细胞术结果表明,与溶剂对照组相比,溶剂对照+慢性应激组小鼠脾细胞凋亡及坏死比例增加(P<0.05);与溶剂对照+慢性应激组相比,HSPC干预+慢性应激组小鼠脾细胞凋亡比例减少,活细胞比例增加(P<0.05)。体内示踪试验结果显示,慢性应激过程中HSPC可迁移至脾中。体外实验结果表明,与脾细胞单独培养组相比,脾细胞+地塞米松组脾细胞凋亡及坏死比例增加(P<0.05);与脾细胞+地塞米松组相比,HSPC干预+地塞米松组脾细胞坏死比例减少,活细胞比例增加(P<0.05)。结论CD34+HSPC可改善慢性约束应激诱导的小鼠脾细胞数的减少。

人肝细胞癌c-myc基因扩增、MTS1/p16基因变异和HBV感染的研究

目的 探讨原癌基因c-myc扩增、抑癌基因MTS1/p16变异以及HBV感染在人肝细胞癌（HCC）发生发展中的作用。 方法 应用差异PCR结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染及激光扫描（d-PCR-PAGE-Laser）技术检测c-myc基因扩增，应用PCR结合单链构象多态（SSCP）银染法分析MTS1/p16基因变异，PCR检测HBV DNA。 结果 (1)29例配对肝细胞癌、癌旁组织中c-myc基因扩增阳性率分别为44.83%（13/29）和51.72%（15/29），两者差异无显著性，P＞0.05；但两者均显著高于肝硬化组织c-myc基因扩增的阳性率8.33%（1/12），P＜0.05。(2)只有3例（10.34%，3/29）肝细胞癌中发现MTS1/p16基因纯合性缺失，未发现MTS1/p16基因突变。(3)正常肝脏、肝硬化和肝细胞癌组织中HBV DNA的阳性率分别为14.29%（2/14）、66.67%（8/12）和96.55%（28/29），三者间差异具有高度显著性，P＜0.001，并且HBV DNA的阳性率随肝脏病情的加重而增高（b＝0.3986, P＜0.001）。(4)29例肝细胞癌中c-myc基因扩增和HBV DNA存在与否无关（P＜0.01）。 结论 (1)c-myc基因扩增和HBV感染与HCC的发生、发展密切相关，HCC中c-myc基因扩增和HBV感染之间无内在相关性。(2)HCC中MTS1/p16基因纯合性缺失和突变的发生频率较低。

常温下一次性和间断肝门阻断对肝损伤的对比研究及还原型谷胱甘肽的保护作用

目的 对比常温下一次性和间断人肝血流阻断法所致肝损伤,并探讨还原型谷胱甘肽的保护作用。方法 SD大鼠32只,按人肝血流阻断方式及是否应用还原型谷胱甘肽(GSH)分为4组,即一次性阻断加和不加GSH(CP和CA)组及间断阻断加和不加GSH(IP和IA)组,每组8只。CP和CA组持续阻断肝门40min,IP和IA组阻断2个20min并间隔5min,再灌注时间为60min。观察指标为肝组织丙二醛(MDA)和铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)含量,血ALT和AST活性及肝组织光镜和电镜观察。结果 组内比较,阻断后血ALT及AST活性较阻断前明显增高,差异有显著意义(P<0.05),MDA和Cu/zn SOD含量则无显著性差异(P>0.05)。再灌注后各值较阻断前均有显著性差异(P<0.05)。组间比较,CP与IP及CA与IA组间各观察值差异均无显著意义(P>0.05)。而再灌注后CP与CA组、IP和IA组比较均有显著性差异(P<0.05)。形态学上,各组阻断后均有细胞损伤表现,再灌注后有所恢复,其中CP和IP组肝细胞结构基本恢复正常,而CA和IA组仍有部分细胞呈空泡变性。各组各时点均未出现不可复性损伤。结论 常温下一次性和间断阻断肝门40min均可导致可复性肝损伤,其程度无明显差异。此时限内一次性阻断是肝切除术中适宜的阻断方法。术中应用GSH对其有明显的对抗作用,可能成为一种新的保护方法。