心肌细胞兴奋-收缩偶联的微观机制

心肌细胞的兴奋 收缩偶联 (ECC)本质上是胞膜上的电压门控L 型钙通道 (LCCs)和胞内ryanodine受体 (RyRs)之间通过钙诱导钙释放 (CICR)机制进行沟通进而引发肌细胞收缩的过程。最近的研究进一步揭示了微观水平上LCCs和RyRs之间的信息联系。在钙偶联位点 (couplons)上 ,LCCs因膜去极化而随机开放 ,在局部产生高强度的钙脉冲 (即钙小星 ,Ca2 + sparklet) ,作用于邻近肌质网终末池上的RyRs。钙偶联位点通过由钙小星随机激活的RyRs(即钙释放通道 )以钙火花 (Ca2 +spark)的形式释放钙。这些钙在全细胞水平上总和即形成钙瞬变 (Ca2 + transient)。因此 ,钙小星触发钙火花就构成了ECC中的基本事件。本文重点阐述LCCs和RyRs分子间的信号转导机制 ,也即从微观水平上探讨CICR及ECC的形成机制。

α_1-肾上腺素受体激活大鼠心脏腺苷酸活化蛋白激酶

为了验证心脏腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是否为肾上腺素受体(adrenergic receptor,AR)的下游信号分子,本实验在大鼠心室肌源细胞和大鼠心脏中观察了α-AR对AMPK的激活作用,利用Western blot检测了AMPK-α总蛋白表达量及其172位苏氨酸磷酸化水平。雄性Sprague-Dawley大鼠皮下植入去甲肾上腺素(norepinephrine,NE),苯肾上腺素(phenylephrine,PE)或者溶剂载体[0．01％(W／V)维生素C]的缓释微泵(osmotic minipump)。NE或PE以每小时0．2 mg／kg的速率持续输注,7 d后用AMPK-α抗体免疫沉淀处理样本并测定AMPK的活性。结果显示,在细胞水平,NE引起的AMPK磷酸化水平增高具有时间依赖和剂量依赖特点, NE处理细胞10 min后AMPK磷酸化水平达到最高峰;NE引起的这种效应对β-AR的拮抗剂普萘洛尔(propranolol)不敏感,但是可以被α1-AR拮抗剂哌唑嗪(prazosin)所阻断。结果提示,α1-AR介导AMPK的磷酸化,但β-AR无此作用。AR激动剂持续灌注7 d后,AMPK的活性在NE(7．4倍)和PE(6．0倍)灌注组较对照组显著增高(P<0．05,H=6)。PE持续灌注组大鼠与对照组相比无明显的心肌肥厚和组织纤维化变化。本文证明α1-AR激动剂可以增强AMPK的活性,揭示了心脏中α1-AR激动在调控AMPK活性方面的重要作用。深入了解α1-AR介导的AMPK激活可能在心衰治疗中具有重要的临床意义。

用于细胞核钙成像的新型钙指示剂的构建与鉴定(英文)

细胞核钙离子是基因转录等细胞核反应过程重要的调控因子.然而,细胞核内钙离子信号的调控机制尚不清楚.缺乏稳定的、敏感的细胞核钙指示剂,是导致其调控机制难以研究的重要原因之一.针对这一问题,设计了能够在细胞核内特异性表达的、具有核定位功能的钙指示剂.以基因编码钙指示剂(GECIs)家族成员GCa MP6为模板,首先融合了对钙离子不敏感的红色荧光蛋白td Tomato来对局部的钙信号进行量化,其次融合了核定位信号(NLS),使GCa MP6能够特异定位于细胞核中.结果表明,NLS-GCa MP6-td Tomato能够在细胞核中有效发挥作用,并且在钙敏感性与动力学上,也与GCa MP6相当.这一新型细胞核钙指示剂将为研究细胞核钙离子的功能及其调控机制提供新的方法与途径.

小鼠巨噬细胞电压依赖内向整流K~+通道及GM-CSF的影响

采用膜片钳技术，在细胞贴附方式下确定并分析了昆明白小鼠腹腔巨噬细胞电压依赖的内向整流型Ｋ＋通道（Ｋｉｒ）及其基本特性。当电极液含１４５ｍｍｏｌ／ＬＫ＋，保持电位Ｖｐ在－３０ｍＶ以上时，该通道电流发放，电导为４３ｐＳ。改变［Ｋ＋］ｏ，通道外延的反转电位Ｅｒｅｖ接近于封接膜片两侧的Ｋ＋平衡电位Ｅｋ，单通道电导正比于［Ｋ＋］ｏ的平方根，但不同［Ｋ＋］ｏ下，激活通道所需驱动电位ＶＤ相同。单通道显示电压敏感性，具有长短两个开放状态和两个关闭状态。除膜电位外，［Ｋ＋］ｏ是此型通道的另一个门控因素，且在膜电位超极化增高的情况下，其作用更加显著。以粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子ＧＭ－ＣＳＦ（１６ｎｇ／ｍｌ）预浴细胞４８小时，该通道开放概率Ｏ．Ｐ．显著升高，通道激活所需驱动电位的阈值显著下降，通道活动更加频繁。

人HCN2基因编码的心脏起搏通道的电生理

目的将人超极化激活的阳离子通道基因2(human hyperpolarization-activated cation channel2,hHCN2)表达于HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点。方法利用全细胞膜片钳技术,记录转染了hHCN2的HEK293细胞上的超极化激活的阳离子流(If)。结果转染hHCN2的HEK293细胞上表达If样内向电流,在超极化时激活,随刺激电压的延长而增大,半数最大激活电压为(-109.1±0.7)mV,曲线斜率为(-12.7±0.7)mV。刺激电压变负时,激活变快。-100mV和-160mV时,激活时间常数分别为(2.5±1.1)s和(217±29)ms。此电流是细胞外钾离子浓度依赖性的,对钠离子和钾离子的相对通透性为0.67。2mmol/L的Cs+可明显抑制此电流。结论目的基因hHCN2在HEK293细胞上成功表达,表达的蛋白能形成有功能的通道,产生If样电流。

双光子显微镜用于在体监测小鼠视交叉上核Ca^(2+)动态变化的方法学研究

目的通过颅底暴露手术联合双光子荧光成像技术实现在体记录视交叉上核(SCN)神经元钙离子活动信号并研究其活动规律的新型方法。方法对麻醉小鼠实行颅底暴露手术,通过双光子荧光显微镜对已注射钙指示剂的活体小鼠SCN核团钙信号进行实时动态测定。结果成功建立一套小鼠颅底暴露SCN核团手术方法,术后应用双光子显微镜清晰地检测到SCN核团钙离子荧光信号,也能够实现稳定的在体细胞钙离子成像,并发现不同自发反应细胞中钙离子活动规律差异。结论通过颅底暴露手术,利用双光子显微镜成功实现了实时监测SCN区域神经元钙离子信号。

足底电击诱导树鼠句条件恐惧记忆模型的建立及抹除

目的探索足底电击诱导树鼩条件恐惧记忆模型的建立及抹除方法。方法测定在无刺激条件下,树鼩在明暗箱中的活动规律;然后用梯度刺激实验测定合适的足底电击电压;最后用合适的电压通过足底电击诱导并建立实验组树鼩条件恐惧记忆模型并抹除其记忆。结果正常条件下,树鼩(n=4)在暗箱中的停留时间明显多于明箱中的停留时间(P<0.01);在两明箱中,足底电压梯度刺激实验显示,随着刺激电压的增加,树鼩(n=6)在有刺激的隔间中的停留时间逐渐减少。12 V以后树鼩在有刺激隔间与无刺激隔间的停留时间差异有统计学意义[12 V(P<0.05)、16 V(P<0.01)、20 V(P<0.01)];实验组(n=4)暗箱用16 V刺激电压足底电击能够形成明显的恐惧记忆(P<0.001)。在形成明显的恐惧记忆后,在明箱中给予相应的足底电击4 d,实验组(n=4)树鼩在明箱中停留的时间逐渐减少,与对照组比较差异无统计学意义。结论树鼩更趋于停留在暗箱中;16V为较为适合的足底电击电压;条件恐惧记忆能够被诱导并且被新的刺激完全抹除。

高浓度葡萄糖促进人二倍体成纤维细胞迅速衰老

利用光学显微镜观察和酸性 β 半乳糖苷酶染色技术研究了高浓度葡萄糖对人二倍体成纤维细胞 2BS细胞衰老进程的影响 ,并用流式细胞仪检测了此过程中活性氧和线粒体膜电位差的变化。结果表明 :2 0 0mmol L的葡萄糖对 2BS细胞有生长抑制作用 ,能引起活性氧含量的变化 ,导致线粒体膜电位差显著下降 ,并诱导了细胞的衰老。这为氧化损伤假说提供了新的证据 ,并为研究活性氧和复制衰老之间的关系提供了较好的体系。

IS4肽插入大鼠骨骼肌细胞膜形成离子通道

根据大鼠脑Ⅰ型Na+通道片段的氨基酸序列人工合成一个 2 2肽———IS4肽 ,在一定的实验条件下IS4肽可嵌入培养的大鼠骨骼肌细胞膜并形成离子通道 .采用膜片箝细胞贴附式方法记录到IS4肽通道的单通道电流 ,IS4通道的单通道电导不均一 ,在不同箝制膜电位下IS4通道的平均开放时间 ,平均关闭时间及平均开放概率不同 ,IS4通道对Na+,K+和Li+有选择性 ,Cl-不能通过IS4通道 .

TNF-α诱导血管内皮细胞的衰老

TNF-α是极为重要的促炎性细胞因子, 在调节细胞免疫反应中起着多种生理和病理作用. TNF- α能激活血管内皮细胞, 继而表达多种细胞因子和黏附分子引发一系列的炎性白细胞浸润和炎症反应. 研究发现TNF-α炎性刺激除了能引起内皮细胞死亡外, 还能诱导内皮细胞的衰老. TNF-α处理的血管内皮细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶染色反应显示阳性, 细胞周期停滞在G0～G1期; 内皮细胞中线粒体膜电位早期上升, 衰老时则降低, 表征早期细胞线粒体功能亢进, 而后期功能衰退; 活性氧水平早期有上升和下降的振荡, 诱导衰老后有所降低. 结果表明线粒体的功能变化与TNF-α诱导的内皮细胞衰老 有关.

呼吸代谢控制在Caspase-3对线粒体凋亡信号正反馈作用中的机制和意义

线粒体通过控制释放促凋亡因子对细胞凋亡的调控起决定作用已经得到广泛认同.Caspase-3是细胞凋亡级联反应下游的一个关键的凋亡执行蛋白水解酶,但同时也有对线粒体的反馈作用,其机制和意义尚不完全清楚.研究了基因重组Caspase-3对线粒体呼吸、氧自由基和跨膜电位的影响.结果表明,重组Caspase-3使分离的小鼠肝线粒体的态4呼吸速率增加,呼吸控制比下降,线粒体氧自由基生成增加,线粒体跨膜电位下降.Caspase-3对线粒体的上述作用依赖其蛋白水解酶活性并通过线粒体膜透过性转运孔（PTP）起作用.实验结果证明Caspase-3对线粒体凋亡信号有正反馈放大作用,并进一步揭示了Caspase-3对线粒体作用的正反馈放大机制.

JPH2基因在二尖瓣疾病合并持续性房颤中的表达

目的：探讨连接蛋白-2（JPH2）基因表达水平与二尖瓣疾病合并持续性房颤的关系以及分子机制。方法34例接受二尖瓣手术治疗的患者，根据术前心律分为两组：房颤组18例，为房颤心律患者；对照组16例，为窦性心律患者。所有二尖瓣手术均采用房间沟入路，取房间沟处左心房组织作心房组织样本。利用蛋白质免疫印迹（ Wester blot ）技术和实时定量逆转录聚合酶链反应（ RT-PCR）技术分别分析JPH2蛋白和mRNA的表达变化，分析miRNA-24在其中的作用。结果与对照组相比，房颤组左心房组织JPH2蛋白表达明显下降（0.94±0.29对1.53±0.61，P＜0.01）；两组JPH2基因mRNA表达水平差异无统计学意义（1.76±1.38对1.15±0.94，P＞0.05）。房颤组患者左心房组织miRNA-24表达显著升高（4.49±4.30对1.72±1.08，P＜0.05）。两组在性别、年龄、左心室射血分数以及心功能分级上并无差别，但房颤组患者左心房内径明显扩大（P＝0.02）。结论房颤时心房细胞JPH2蛋白表达水平明显下降，调控其表达的miRNA-24水平明显增加，这可能是房颤发病的分子机制之一，可致房颤心房重构及收缩功能受损。

HEK293细胞上表达的人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2和亚型4的电生理

目的将人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2(hHCN2)和亚型4(hHCN4)的基因表达于 HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点。方法包含目的基因 hHCN2或hHCN4的 cNDA 亚克隆到腺病毒穿梭载体 pAdTrack-CMV,穿梭载体和病毒骨架载体 pAdEasy-1在大肠杆菌重组,病毒经过包装和扩增后分别转染 HEK293细胞。利用全细胞膜片钳技术,记录分别转染了 hHCN2和 hHCN4的 HEK293细胞上的超极化激活钾电流(I_f)。结果转染 hHCN2和 hHCN4的HEK293细胞上产生超极化激活的内向电流。两种通道的半数最大激活电压分别为-114.8 mV±3.3 mV 和-125.9 mV±2.9 mV,反向曲线斜率分别为11.1 mV±1.2 mV 和13.7 mV±1.3 mV。两者的激活动力学明显不同,刺激电压为-110 mV 时,通道的激活时间常数分别为0.99 s±0.21 s 和8.47 s±2.85 s。两种通道对钠离子和钾离子的相对通透性分别为0.40和0.34。两种电流均可被2mmol/L 的氯化铯(CsCl)阻断。结论目的基因 hHCN2和 hHCN4在 HEK293细胞上成功表达,形成的两种通道具有明显不同的激活动力学。

Bid-BH3结构域短肽对线粒体PTP的作用及其机制

在细胞凋亡过程中,线粒体通过释放促凋亡因子对细胞凋亡进行调控.而促凋亡因子的释放主要是由Bcl-2家族成员相互作用来调控的.Bcl-2家族成员在线粒体中的主要作用位点是内外膜接触点上的膜透过性转运孔（PTP）.应用体外方法来探讨促凋亡蛋白Bid的BH3结构域短肽对线粒体及其PTP的作用.实验发现促凋亡蛋白Bid的BH3结构域短肽能作用于线粒体PTP,引起线粒体肿胀、跨膜电位下降和细胞色素c释放;而突变的Bid-BH3结构域短肽因为不能与抑凋亡蛋白Bcl-xL结合而没有上述作用.此外,Bcl-xL和环胞菌素A（CsA）能抑制Bid-BH3短肽引起的线粒体膜通透性改变.以上结果说明,Bid-BH3短肽通过作用于线粒体PTP而使得线粒体膜通透性改变,可能通过Bid-BH3与Bcl-xL的结合并抑制Bcl-xL的抑凋亡进而实现促凋亡作用.对合成的Bid-BH3短肽促凋亡作用的研究,为将来研究细胞凋亡调控药物提供了基础.