分子内分子伴侣──Pro肽在蛋白质折叠中的作用

在体内，许多蛋白质，如很多胞外蛋白酶、某些多肽激素等都以含前导肽的前体形式合成。前导肽在蛋白质折叠中具有分子伴侣的功能。为了与一般意义上的分子伴侣相区别，人们将对蛋白质折叠有帮助的前导肽称为分子内分子伴侣。分子内分子伴侣帮助蛋白质在折叠过程中克服高的能量障碍，某些蛋白质的分子内分子伴侣甚至促进其在氧化性折叠中二硫键的正确配对。

G蛋白Rab3a cDNA的克隆与表达

利用PCR法 ,从人胎盘总cDNA中扩增得到Rab3acDNA的全编码区 .序列分析表明 ,扩增得到的Rab3acDNA有 5个核苷酸发生了变异 ,但翻译的氨基酸与发表的完全一致 .将扩增得到的Rab3acDNA克隆于原核融合表达载体pGEX 4T 1中 ,在E .coliBL2 1中经IPTG诱导表达 .为了进一步鉴定表达产物 ,对纯化后的Rab3a蛋白进行了SDS PAGE、N端氨基酸测序、质谱分子量测定及氨基酸组成分析鉴定 .结果显示 ,表达蛋白的分子量约 2 5kD ,N端氨基酸序列为MASATDSR ,氨基酸组成分析表明 。

生长抑制因子(GIF)与G蛋白Rab3a直接相互作用

生长抑制因子 (growthinhibitoryfactor,GIF) ,又称金属硫蛋白 3,为 6 8个氨基酸组成的脑特异性金属硫蛋白 ,具有广泛的生理功能 ;GIF可能与阿尔茨海默氏症 (Alzheimer s)病理相关 ,在Alzheimer s脑提取物存在下 ,还对神经细胞具有特异的生长抑制活性 .然而 ,对其发挥生长抑制作用的分子机制并不清楚 .运用酵母双杂交系统从人脑cDNA文库中筛选与GIF相互作用因子 ,从 4 1× 10 6个人脑cDNA文库转化子中 ,首次筛选到Ras家族G蛋白Rab3aC端 ,包含 87个氨基酸的片段能与GIF相互作用 ;用PCR自人胎盘总cDNA中获得包含完整Rab3a编码序列的cDNA ;通过酵母双杂交实验表明 ,全长Rab3a蛋白亦能与GIF相互作用 .免疫共沉淀和蛋白质印迹实验进一步验证了GIF与Rab3a在哺乳动物细胞中可以相互作用 ;而且 ,Rab3a是以GTP结合形式(GTP Rab3a)

维甲酸诱导基因Ⅰ研究进展

维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ),能在多种细胞中被不同的刺激诱导表达,是RNA病毒致天然免疫的重要调控因子.概述其发现、诱导、结构、功能、机理及同源蛋白等的研究现状,并展望相关动向.

抗凝活性肽RGD226基因构建、表达、产物纯化及活性分析

通过PCR法 ,将来源于蛇毒蛋白质eristostatin中的一段含有RGD(Arg Gly Asp)序列的十三肽(SRVARGDWNDDYS)的基因 ,以一个无胰岛素活性但保留天然免疫原性的胰岛素原突变体(PJG4 0 1)基因为模板 ,置换其B2 8和A1位之间的连接肽基因 ,构建成了能展示RGD功能序列的人源化分子 (RGD2 2 6 )的基因 .通过该基因在大肠杆菌中的表达、产物分离纯化 ,得到高纯度RGD2 2 6 .该RGD肽对由ADP诱导的体外人血小板聚集的半抑制浓度IC50 为 2 2 3μmol L .其胰岛素免疫活性是PJG4 0 1的 15 1% ,提示其在一定程度上保留了胰岛素原的免疫原性 .其受体结合活性不到PJG4 0 1的 0 1% ,说明其胰岛素的生物活性基本丧失 .动物实验证实 ,RGD2 2

转BmK IT_4基因烟草的抗虫性

用酶切方法从pBS_BmKIT4 质粒中获得BmKIT4 基因片段 ,并构建CaMV 35S启动子下的BmKIT4 基因表达质粒pE3_BmKIT4 ,以根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)介导的叶盘法转化云烟 (Nico tianatabacumL .)K32 6叶片 ,获得 45株抗卡那霉素的再生植株。用这些再生植株进行抗虫试验 ,发现有 2株植株对烟草天蛾 (Manducasexta (Linnaeus) )、棉铃虫 (Heliothisarmigera (H櫣ｂｎｅｒ) )和大豆食心虫 (Leguminivoraglycinivorella(Matsumura) )都有较强的抗性。收获这 2株烟草的自交种子后 ,对T1代幼苗进行Southern杂交分析表明 ,BmKIT4基因已转入这些烟草中 ,用这些子代植株进行抗虫试验 ,与对照株相比 ,这 2株转基因烟草对烟草天蛾的杀虫率达95 %～ 97% ,对棉铃虫的杀虫率达 6 3%～ 70 % ,对大豆食心虫的杀虫率达 6 5 %～ 73% ,并能显著抑制昆虫的蜕皮和生长发育 ,表现出强烈的抗虫作用。

G-蛋白Rab3a对神经生长抑制因子(GIF)抑制神经元细胞生长作用的影响

为了深入研究Rab3a和神经生长抑制因子(GIF)的相互作用,在大鼠海马神经元细胞原代培养体系中,用MTT还原法定量研究了Rab3a对GIF神经生长活性的影响,发现Rab3a可以替代脑提取物而使GIF发挥神经生长抑制活性.接着又利用多克隆抗体方法研究了GIF与Rab3a的相互作用,结果说明Rab3a是GIF发挥神经生长抑制活性所必需的蛋白质,并且它们的相互作用受空间位置的因素影响较大.在随后对它们相互作用的机理和可能的生物学意义进行了讨论.

中药天花粉蛋白的定点突变及突变体的活性检测

选择天花粉蛋白 (Trichosanthin ,TCS)分子中两个可能的抗原决定簇位点 :Tyr81 Phe82 Phe83和Tyr94 Val95 Phe96进行了定点突变 ,将它们分别替换成Ala81 Gly82 Ser83和Ala94 Val95 Gly96。这两个突变体蛋白分别在大肠杆菌中成功地表达进行纯化 ,纯化后的突变体蛋白经初步检测发现其活性与野生型蛋白的活性几乎相同 ,而YFF81 83AGS突变体的免疫原性有所降低。

鸟类血红蛋白的四级结构和残基选择性特征

对目前已知结构的三个鸟类血红蛋白与哺乳类和硬骨鱼类血红蛋白的晶体结构数据进行了比较 ,发现鸟类、硬骨鱼类和哺乳类血红蛋白具有不同的四级结构特征 ,鸟类和硬骨鱼类血红蛋白的各亚基间的距离比哺乳类血红蛋白大 ,其中 ,α1 - β1亚基间的距离为 :硬骨鱼类Hb>鸟类Hb>哺乳类Hb ;α1 - β2、α1 -α2和β1 - β2亚基间的距离以及两个αβ 二聚体的距离为 :鸟类Hb>硬骨鱼类Hb>哺乳类Hb。进一步由一级结构的比较发现 ,鸟类、硬骨鱼类和哺乳类血红蛋白具有不同的残基选择性。鸟类和硬骨鱼类血红蛋白倾向于选择侧链更大的残基 ,这些大侧链残基主要分布于分子表面和亚基之间的界面 ,导致四级结构的差异。三类血红蛋白四级结构的微妙差异与它们的协同效应中有机磷效应物的分子大小和形状不同有关 ,鸟类、硬骨鱼类和哺乳类血红蛋白似乎在进化过程中选择了不同大小的残基而进化形成稍有不同的四级结构 ,从而适应与不同的有机磷化合物相结合。

四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的胰岛素原基因治疗

为了解决基因治疗中的安全性问题 ,和寻求一种简便而又经济的糖尿病基因治疗模式 ,采用腹腔注射四氧嘧啶的方法 ,以昆明小鼠为实验对象 ,成功地建立了糖尿病小鼠模型 .通过电穿孔的基因转移 ,将含有胰岛素原cDNA的质粒pCMV IN转移到这些小鼠的股四头肌 .反转录PCR的结果表明 ,转基因在转染部位有转录活性 ,而放射免疫分析结果却表明转基因的表达产物分泌进了小鼠的血循环系统之中 .血糖浓度的变化说明 ,这些产物具有明显的降血糖效果 .在电基因转移前对转移部位用透明质酸酶处理 ,使电激时的使用电压降低 ,增加了转移效果 ,也更加安全 .

利用热诱导的位点专一性重组系统在烟草中控制基因表达(英文)

采用热激启动子Gmhsp17.5C控制Cre定位重组酶介导的DNA删除系统。在这个系统中,在热激启动子控制下的Cre重组酶的表达导致两侧带有相同方向loxp位点的CaMV35S-GUS片段从转基因烟草(Nicotiana tabacum L.cv.W38)的基因组中删除。通过定量PCR的方法鉴定这个转基因系统,显示了这个系统的重组效率。结果显示在两个小时热激处理后转基因烟草中有41%的CaMV35S-GUS片段被删除。由于热激诱导的定点重组系统有容易操作、对热敏感和无背景表达等优点,因此有利于采用这个系统在转基因植物中进行可诱导的基因操作。

快速筛选雌激素类环境激素的方法探讨

目的 开发快速筛选环境激素的检测方法。方法 将构建的表达人α雌激素受体的载体pcDNA 3 1-ER和含雌激素受体反应元件的荧光素酶报告基因载体pGL3 -tk -ERE共转染到HeLa细胞中 ,以雌二醇或被检样品双酚A诱导雌激素受体表达后检测荧光素酶活性。结果 报告基因载体中的荧光素酶的表达受雌激素受体反应元件的调控 ,且在一定浓度范围内荧光素酶的活性与雌二醇的加入量成线性关系 ;疑为有雌激素样作用的双酚A也显著诱导荧光素酶基因的表达。结论 本方法经济、简便、快速 。

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分序列的测定

以新鲜蚯蚓为原料，经过保温抽提、乙醇沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析、Lysine-Sepharose4B亲和层析以及SDS-PAGE制备电泳等纯化步聚，得到一种纯度达95％以上的蚯蚓纤溶酶．该酶具有强烈的溶解纤维蛋白的作用及蛋白酶活性，平板法测得其比活性为90OUK单位／毫克蛋白，TAME法测得其比活性为2500O单位／毫克蛋白．酶学性质研究表明其最适反应温度为65℃，最适反应PH值为8．5．该酶的分子量为33kD，等电点为pH3．5．还对该酶进行了氨基酸组成分析，并测定了其N端部分序列．

巨噬细胞的激活诱导死亡

淋巴细胞的激活诱导细胞死亡(AICD)的分子机制已经得到了广泛的研究。巨噬细胞中也存在AICD,但是诱导巨噬细胞AICD的分子机理仍不是很清楚。最近,一些研究表明zVAD或IFNγ通过提高MEF2C蛋白稳定性,从而增加其在巨噬细胞中的含量。MEF2C和TLR2、4信号通路一起,诱导了Nur77的表达。Nur77的表达介导了巨噬细胞的凋亡。LPS激活的ERK和p38是诱导Nur77表达和细胞凋亡所必需的。p38/STAT1/ROS途径也介导了巨噬细胞的AICD。撤除血清诱导的巨噬细胞凋亡可能是一种新的巨噬细胞AICD模型。这些发现将有助于我们对巨噬细胞AICD的进一步了解。

苏云金芽孢杆菌Cry1Aa蛋白α4螺旋形成跨膜离子通道的昆虫毒性试验与模型预测

研究野生型苏云金芽孢杆菌Cry1Aa和Cry1C的毒性变化发现,不同的pH不但影响这些蛋白质的毒性,而且影响它们在跨膜过程中形成孔洞的能九将 Cry1 Aa α4螺旋中的15个氨基酸突变后与BBMV结合,进行光散射分析,与野生型Cry1Aa相比较,发现有3个突变体几乎完全失去毒性,7个突变体毒性明显降低,5个突变体保持野生型毒性.采用计算机模拟方法研究了苏云金芽孢杆菌Cry1Aa毒蛋白α4螺旋的三维空间结构,通过观察15个不同残基定点突变对其功能的影响,解释了突变体毒性变化的原因,说明了参与膜孔洞形成氨基酸残基对Cry1Aa昆虫毒杀性的重要作用.